论文摘要
研究背景肾素-血管紧张素系统（renin angiotensin system,RAS）在动脉粥样硬化（atherosclerosis,As）形成中起着重要作用,血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）是系统中的关键效应肽,通过诱导炎症反应及细胞凋亡、促进氧化型低密度脂蛋白摄取、产生氧自由基和影响纤溶功能等多方面参与动脉粥样硬化的病理过程,阻断AngⅡ的生物学效应可通过抗高血压、抗炎、抗增殖和氧化应激等产生强大的抗As作用。研究发现,AngⅡ与氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）在As发生过程中有着协同作用,AngⅡ通过促进低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）氧化修饰及修饰后LDL摄取,参与As的发生,而ox-LDL可调节RAS活性成分表达,增加AngⅡ的生物学效应。血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）是2000年发现的RAS新成员,是血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）的同系物,人类ACE的第一个同源基因,在心脏和肾脏血管内皮细胞高表达,主要功能是转化AngⅡ直接产生血管紧张素（1-7）（angiotensin（1-7）,Ang（1-7））,还可裂解血管紧张素Ⅰ（angiotensinⅠ,AngⅠ）生成血管紧张素（1-9）（angiotensin（1-9）,Ang（1-9））,Ang（1-9）继续被ACE水解为Ang（1-7）。在功能上,ACE2广泛参与高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化、糖尿病、慢性肝损伤、急性呼吸窘迫征、妊娠等疾病的发生、发展过程。已有研究发现,血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin-converting enzymeinhibitor,ACEI）能抑制As形成,但在人血管组织中,AngⅡ的生成60%～80%来源于糜酶的作用,ACEI并不能完全阻止AngⅡ生成,而ACE2作为能转化AngⅠ和直接降解AngⅡ的血管调节肽酶,能降低局部组织AngⅡ,增加Ang（1-7）浓度,在动脉斑块内的新生内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞均已发现ACE2高度表达,分析其具有抗动脉粥样硬化作用。他汀类药物作为降脂药物,其抗As机制仍是目前研究的热点,近年来,阿托伐他汀的非调脂作用越来越引起关注。系列临床研究及实验证据均发现他汀类药物能调节RAS,通过下调血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensinⅡtype 1receptor,AT1R）mRNA表达及受体密度,削弱AngⅡ的生物学效应。阿托伐他汀作为最新一代羟甲基戊二酰辅酶A（hydroxy-methyl-glu taryl coenzyme A,HMG-CoA）还原酶抑制剂,除了具有调脂作用外,还具有抗炎、抗氧化、抗凝等非调脂作用,从而起到稳定斑块和抗As的目的。Ox-LDL能与其特异受体-血凝素样氧化型低密度脂蛋白内皮受体（Lectin-like Oxidized Low Density Lipoprotein Receptor-1,LOX-1）结合进入血管壁,上调血管平滑肌细胞AT1R及内皮细胞ACE表达等诱导As形成,但其能否通过影响ACE2的表达来调节RAS活性成分以及阿托伐他汀对该过程有何影响,目前还不十分清楚。针对以上问题,本研究采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）及蛋白质Western印迹法（western blot）,在细胞生物学水平观察ox-LDL及阿托伐他汀对培养的人脐静脉内皮细胞（human vascular endothelial cells,HUVECs）ACE2基因和蛋白表达的影响,为临床防治As提供理论基础。目的1、观察ox-LDL在翻译和转录水平对HUVECs表达ACE2的影响。2、观察阿托伐他汀对ACE2表达的影响及对ox-LDL的干预作用。3、探讨ox-LDL、阿托伐他汀及内皮细胞ACE2表达三者间是否存在某种联系及在动脉粥样硬化形成中的作用机制。对象和方法1对象体外条件培养的人脐静脉内皮细胞。设计:观察对比实验。2方法2.1 ox-LDL制备:采用超高速密度梯度离心法从健康人新鲜血液分离出LDL,并将蛋白终浓度调整为500ug/mL,加入终浓度为10mmol/mL的CuSO4溶液中氧化,在浓度为100μmol/L的EDTA溶液中终止氧化。Ox-LDL纯度鉴定:用琼脂糖凝胶电泳法鉴定ox-LDL纯度,电泳条带为单一条带。Bradford法测定蛋白含量。2.2阿托伐他汀溶液配制:阿托伐他汀原料药60.47mg,溶于1ml无水乙醇,加入0.1 mol/L NaOH 1.5ml,50℃水浴锅中静置2h,以0.1mmol/LHCl调pH至7.2,加PBS至总体积5ml,过滤后分装,-70℃冻存,贮存浓度为10mmol/L。2.3 HUVECs细胞株复苏、传代:冻存细胞株复苏后接种于M199完全培养基（pH7.4,含10%FBS、50 ng/L的ECGS、5 kU/L肝素、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素）,置37℃、5%CO2培养箱中培养,隔天换液一次,2—3d后铺满培养瓶。0.25%胰蛋白酶进行消化、传代,取3-6代增殖细胞制成细胞悬液。按2.0×106个细胞/孔的细胞密度接种于6孔板,加含10%FBS的M199培养基置于37℃、5%CO2孵箱中进行培养,待HUVECs生长呈亚融合状态时,换以无血清培养基培养24h后,分别加入不同浓度ox-LDL及阿托伐他汀刺激。2.4实验分组及条件培养（各组均设6个复孔,n=6）:2.4.1 Ox-LDL对ACE2表达的影响（1）空白对照组:加入等量无血清培养基与HUVECs孵育24h。（2-4）不同浓度ox-LDL组:终浓度分别为20mg/L、40mg/L和80mg/L的ox-LDL与HUVECs孵育24h。（5-7）不同时间ox-LDL组:40mg/L的ox-LDL分别与HUVECs孵育6h、12h和24h。2.4.2阿托伐他汀对ACE2表达的影响及对ox-LDL的干预作用（1）空白对照组:加入等量无血清培养基与HUVECs孵育24h。（2-4）不同浓度阿托伐他汀组:终浓度为1umol/L、5umol/L和10 umol/L的阿托伐他汀与HUVECs孵育24h。（5-7）不同时间组:5umol/L的阿托伐他汀分别与HUVECs孵育6、12和24h。（8-10）共同刺激组:8:浓度为40mg/L的ox-LDL与HUVECs孵育24h作为对照组。9-10:1umol/L和10umol/L的阿托伐他汀分别与HUVECs孵育1h后加入40mg/L的ox-LDL孵育24h。2.5 RT-PCR检测ACE2 mRNA表达:提取细胞样品总RNA,设计内参GAPDH及ACE2引物,采用RT-PCR扩增,产物在1.5%琼脂糖中进行电泳,分析电泳条带灰度值,各组间以ACE2/GAPDH比值进行比较。2.6 Western blot检测ACE2蛋白表达:提取细胞蛋白,电泳后进行转膜,膜在封闭液中封闭后先后结合一抗和二抗,孵育后进行化学发光反应,胶片扫描后测定目的蛋白的灰度值,与内参GAPDH的灰度值比较进行半定量分析。3统计学方法数据以均数±标准差（（?）±s）表示,多组均数间比较进行方差齐性检验和单因素方差分析,组间多重比较采用LSD法。采用SPSS 11.5统计软件对数据进行统计学分析,P≤0.05为差异有统计学意义。结果1 HUVECs鉴定及细胞活力测定:在倒置显微镜下,HUVECs呈单层生长,呈梭形鱼贯状排列或呈多角形镶嵌排列。Ⅷ因子单抗间接免疫荧光染色结果显示所培养的细胞表达较高密度的Ⅷ因子相关抗原,阳性率为100%,证明所培养的细胞为内皮细胞。台盼蓝染色后细胞记数结果显示各组HUVECs存活率在96%以上。2 Ox-LDL对ACE2基因及蛋白表达的影响:基础状态下,培养的HUVECs即有ACE2 mRNA及蛋白表达。不同浓度ox-LDL均显著下调ACE2基因和蛋白表达（F=57.438,P＜0.001和F=42.299,P＜0.001）。与空白对照组比较,各浓度ox-LDL刺激组ACE2 mRNA表达量分别降低为空白对照组的73%、51%和33%（均P＜0.001）,蛋白表达量降低为空白对照组的81%、50%及32%（P=0.010,P＜0.001,P＜0.001）,不同浓度组间ACE2 mRNA比较差异亦有显著性（P=0.000,P=0.004,P=0.001）,蛋白表达同样存在显著性差异（P=0.000,P=0.014,P=0.000）。40mg/L ox-LDL在不同时间均显著下调ACE2基因和蛋白表达（F=36.483,P＜0.001和F=24.985,P＜0.001）。于6、12和24h,ACE2 mRNA表达量分别降低为空白对照组的66%、56%和50%（均P＜0.001）,蛋白表达降低为空白对照组的63%、53%及49%,差异有统计学意义（均P＜0.001）。3阿托伐他汀对ACE2基因及蛋白表达的影响:在不同浓度阿托伐他汀刺激组,ACE2 mRNA及蛋白表达比较无统计学差异（F=1.566,P=0.299和F=0.867,P=0.474）,不同时间各组差异同样不存在显著性（F=1.102,P=0.257和F=0.371,P=0.858）)。4阿托伐他汀对ox-LDL下调ACE2基因及蛋白表达的干预作用:阿托伐他汀能抑制ox-LDL对ACE2基因和蛋白表达的下调效应（F=28.199,P＜0.001和F=20.321,P＜0.001）。1umol/L阿托伐他汀干预组与单纯40mg/Lox-LDL对照组比较,ACE2 mRNA及蛋白表达没有显著性差异（P=0.071和P=0.188）。10umol/L阿托伐他汀干预组与对照组比较,ACE2mRNA及蛋白表达分别增加了1.75、1.69倍,差异均有统计学意义（P＜0.001）。高浓度（10umol/L）与低浓度（1umol/L）阿托伐他汀干预组比较,基因及蛋白表达同样均存在显著性差异（P＜0.001）。结论1、不同浓度及不同时间ox-LDL均下调静脉内皮细胞ACE2基因及蛋白表达。2、阿托伐他汀单独对静脉内皮细胞ACE2基因及蛋白表达没有影响。3、阿托伐他汀能抑制ox-LDL下调ACE2表达,高浓度较低浓度阿托伐他汀具有更显著的效果。阿托伐他汀通过这种作用发挥心血管系统保护作用。
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