NF-κB在ONO-AE-248诱发中性粒细胞非凋亡、非坏死性死亡中的作用

论文摘要

目的:中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil,PMN）是机体最重要的炎症细胞,它在炎症部位的过度聚集可能导致自身组织细胞的二次损伤和引起炎症相关性疾病。中性粒细胞具有终末分化的特性,一旦分化成熟,便启动它的自发性凋亡（spontaneous apoptosis）程序,这一机制在促成炎症的无损伤性收敛和维持机体内环境的稳定中发挥重要作用。然而,近期研究结果表明,凋亡并非是程序化细胞死亡的唯一形式。本课题前期研究发现,前列腺素E2受体亚型3（EP3）的激动剂ONO-AE-248可以诱导人中性粒细胞发生“非凋亡、非坏死性细胞死亡”,并且在中性粒细胞自发性凋亡中起重要作用的细胞内生物化学信号caspase-3、caspase-8和p38-MAPK未被ONO-AE-248活化,表明它们不参与中性粒细胞非凋亡性细胞死亡的信号传递途径,高度提示这种新型细胞死亡存在有自己独特的细胞生物化学信号传递途径。核转录因子（nuclear factor-κB,NF-κB）是调控炎症反应和细胞凋亡过程中基因表达的关键因子。为了进一步研究ONO-AE-248诱发的中性粒细胞非凋亡非坏死性死亡的分子机制,本研究将探讨在中性粒细胞自发性凋亡中发挥了重要调节作用的核转录因子NF-κB在这种特殊的细胞死亡形式中的作用。通过研究,从信号转导水平探索ONO-AE-248诱发的中性粒细胞非凋亡非坏死性死亡与正常中性粒细胞凋亡不同的分子调控机制,从而为确认这种细胞死亡形式是否是一种新型的细胞死亡形式提供进一步的实验室证据。方法:Ficoll密度梯度法分离、纯化健康人外周静脉血中性粒细胞,在分别加入ONO-AE-248、LPS、TNF-α和不加任何刺激物情况下培养,构建非凋亡非坏死细胞死亡、凋亡延迟、凋亡加速和自发性凋亡的细胞模型。台盼蓝拒染试验和Wright-Giemsa混和染色后用光镜检测新鲜分离的中性粒细胞的活性和纯度;用流式细胞术（FCM）检测、分析、对比非凋亡非坏死性细胞死亡和自发性凋亡的凋亡率和DNA核型分析;低分子量DNA琼脂糖电泳检测非凋亡非坏死性细胞死亡组和自发性凋亡组DNA片段化（DNA fragmentation）情况;提取ONO-AE-248非凋亡非坏死性细胞死亡、LPS凋亡延迟、TNF-α凋亡加速和自发性凋亡组中性粒细胞总蛋白,SDS-PAGE观察各组蛋白表达情况;用抗IκBα多克隆抗体和内参β-actin单克隆抗体通过Western blotting技术检测并比较IκBα在不同死亡模型中的蛋白表达水平,从而分析NF-κB的活化状态;RT-PCR技术检测NF-κB调节的基因产物XIAP（X-linked inhibitory apoptosis protein）、DAD1（defender against apoptotic death）、FLIP（FLICE inhibitory protein）和DFF40（DNA fragmentation factor 40）的mRNA表达水平。结果:1.光镜显示:新鲜分离、纯化的中性粒细胞活性和纯度均> 96%;2.运用流式细胞术对中性粒细胞自发性凋亡和非凋亡非坏死性死亡进行亚二倍体检测,发现中性粒细胞经ONO-AE-248刺激后凋亡率仅为26%,DNA直方图上亚二倍体峰不明显;而自发性凋亡则为67%,出现明显的亚二倍体峰（P < 0.05）。3.低分子量DNA琼脂糖电泳显示,自发性凋亡组生成180 bp整数倍的DNA梯形条带（DNA ladder）,非凋亡组出现短而弥散的DNA电泳谱带,主要分布在分子量较大的区段。4.培养12 h后,将各组死亡模型组中性粒细胞裂解,抽提总蛋白进行SDS-PAGE并相互比较。结果显示,在不同刺激物刺激下,中性粒细胞蛋白质表达的性质和数量发生了不同程度的改变。5.不同时间段提取中性粒细胞蛋白,用Western blotting技术检测并比较IκBα的蛋白表达水平。结果显示:LPS和TNF-α均能促进IκBα降解,使IκBα的表达水平降低,说明LPS和TNF-α均可以促使NF-κB活化;ONO-AE-248组与自发性凋亡组相比IκBα的表达量无明显变化。6. RT-PCR分析NF-κB调节的基因产物XIAP、DAD1和FLIP的mRNA表达水平。结果显示:LPS组XIAP、DAD1和FLIP三个基因的表达均增加,ONO-AE-248、TNF-α与自发性凋亡组比较三个基因表达均无明显改变（P > 0.05）。7. RT-PCR分析DNA断裂因子DFF40基因表达水平发现,与自发性凋亡组比较,TNF-α组表达增加,LPS组无明显变化,而ONO-AE-248刺激组表达水平明显降低（P < 0.01）。结论: 1.核转录因子NF-κB不参与ONO-AE-248诱导的人中性粒细胞非凋亡非坏死性死亡的信号转导途径。2. DNA断裂因子DFF40表达下调可能是ONO-AE-248诱导的人中性粒细胞非凋亡非坏死性死亡没有DNA小片段化的主要原因之一。3.本项研究的实验结果提示中性粒细胞自发性凋亡可能并不是机体内中性粒细胞无损伤性收敛的唯一形式。

论文目录

• 1 NF-κB 在ONO-AE-248 诱发中性粒细胞非凋亡、非坏死性死亡中的作用
• 1.1 中文摘要
• 1.2 英文摘要
• 1.3 前言
• 1.4 材料与方法
• 1.5 结果
• 1.6 讨论
• 1.7 结论
• 1.8 参考文献
• 1.9 英汉缩略词对照表
• 2 致谢
• 3 蛋白激酶C 在中性粒细胞凋亡信号转导中的作用（综述）