甘蓝型油菜Cr3529正向消减文库部分片段的序列分析及反向文库中一个未知蛋白基因的cDNA克隆

论文摘要

为了从可能的差异表达基因入手研究甘蓝型油菜幼叶黄化突变体Cr3529黄化性状的成因,从本实验室构建的野生型3529——突变体Cr3529正向抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)文库中选取了33个克隆进行序列分析。测序结果显示,33个克隆中,7、14号克隆为重复的克隆,二者大小相同,且只有一个碱基的差异;15、18号克隆为同一基因的不同片段;其余均为独立的克隆。BLASTn和BLASTx分析的结果表明,11、22、31号克隆与捕光色素chla/b结合蛋白同源,3、17分别与PSⅡ反应中心及其相关的蛋白同源,另外15和18号克隆与推测的chl P基因有着较高的同源性,该基因被认为参与叶绿素的合成。由此可以初步证实本实验室关于突变体的黄化性状与光合作用,特别是叶绿素的合成相关的推测。此外,对其余克隆的序列分析表明,这些克隆涉及到氨基酸代谢、糖代谢、脂肪酸代谢等多个代谢过程,初步说明了黄化性状还可能涉及到各个代谢途径。 为了研究反向消减文库中一个未知基因功能,利用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,在已知片段的基础上,对该基因的5’端cDNA进行了扩增,经过两轮PCR得到了该基因5’端约1000bp的序列,将之与原有已知片段拼接得到一个大小为1343bp的片段,序列分析发现该片段的1～1299位碱基为基因编码区;BLAST分析表明,该基因与来自拟南芥的一个编码未知蛋白质的基因(GenBank登录号At4g01080)同源性达80.1%,但由于单个碱

论文目录

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• 第一章 甘蓝型油菜 Cr3529正向消减文库中分部片段的序列分析
• 1. 材料和工具
• 1.1 消减文库及菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 其他
• 2. 实验方法
• 2.1 菌种的活化
• 2.2 测序及测序结果的预处理
• 2.3 序列的BLASTn分析处理
• 2.4 序列的BLASTx分析
• 3. 结果和讨论
• 3.1 测序结果
• 3.2 序列分析结果及讨论
• 3.3 差异表达基因与幼叶黄化相关性的分析
• 4. 小结
• 5. 参考文献
• 第二章 甘蓝型油菜Cr3529中一个未知功能蛋白基因的cDNA克隆
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 叶片总RNA和mRNA的提取
• 2.2 BnCr17 cDNA5′-RACE
• 2.3 RACE片段的克隆
• 2.4 cDNA全长克隆
• 2.5 全长BnCr17的序列分析
• 2.6 Northern blot结果分析
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 5. 参考文献
• 第三章 文献综述 一种克隆基因全长cDNA的分子生物学方法——Rapid Amplification of cDNA Ends（RACE）
• 1. RACE 技术简介
• 1.1 RACE技术产诞生的技术背景
• 1.2 RACE技术基本原理
• 1.3 RACE技术的优点
• 2. RACE技术的缺点及改进
• 2.1 克隆效率受反转录效率的限制
• 2.2 克隆效率受PCR反应效率的限制
• 2.3 PCR反应特异性差带来扩增背景
• 2.4 TdT酶加尾的局限性及改进方法
• 3. RACE技术的注意事项
• 3.1 3′RACE的注意事项
• 3.2 5′RACE的注意事项
• 4. RACE技术在其他方面的应用
• 4.1 用于构建cDNA文库
• 4.2 用于筛选cDNA文库
• 4.3 用于克隆已知片段的旁侧序列
• 4.4 用于定点删除序列
• 4.5 用于同源基因克隆
• 4.6 与生物信息学相结合
• 5. 小结
• 6. 参考文献
• 硕士期间发表论文情况
• 致谢
• 声明