小盐芥C2H2类锌指蛋白基因ThZF1的克隆及其功能研究

论文题目: 小盐芥C2H2类锌指蛋白基因ThZF1的克隆及其功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 许守明

导师: 陈珈

关键词: 型锌指蛋白,克隆,转录因子,小盐芥,胁迫

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 世界各地的农业生产都面临着日趋恶化的环境威胁,干旱和盐的威胁因其广泛性而首当其冲。十年来,人们广泛利用拟南芥作为遗传模式植物,对胁迫的信号应答和调控途径,以及转基因工程等方面开展了深入研究,为阐明植物胁迫耐受性形成的分子机理,加快作物遗传改良的步伐奠定了基础。盐生的拟南芥的亲缘物种小盐芥,近来开始作为一种盐生遗传模式植物,用于植物耐盐分子遗传学等方面的研究,这将有助于我们更好地理解植物胁迫耐性的相关机理。 锌指类蛋白是一类重要的转录因子,在动植物的生长发育中均起着重要作用。近来,在拟南芥中发现了多个锌指蛋白,其中包括C2H2类的锌指蛋白比如AZFs等,又称为TFⅢA类型锌指或经典锌指,是真核生物转录因子中研究最多的一种与DNA结合的结构模式。它们参与了植物发育以及胁迫应答的调控过程,在植物对逆境的适应性调节反应中扮演了重要角色。但是,在盐生植物中尚未见此类基因的序列及蛋白功能的报导。 本研究采用EST策略并结合RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术,成功地从盐生模式植物小盐芥的幼苗叶片中克隆了一个C2H2类型的锌指蛋白基因ThZF1。并对其表达特征,转录因子特性及转基因植物中的功能进行了初步研究。 研究结果表明,小盐芥了TZF1 cDNA编码蛋白由276个氨基酸组成,推测其分子量为30 kD,等电点8.27。它与拟南芥AZF2有最高的同源性,同源性达79%。推测的小盐芥ThZF1蛋白没有跨膜区,为水溶性蛋白。它包含两个C2H2锌指结构域,每个C2H2锌指结构域都具有植物特有的序列QALGGH,是典型的TFⅢA型锌指蛋白。N端的B-Box可能是其核定位（NLS）序列,另外还发现了L-Box,DNL-Box等结构序列。 利用Northern杂交和RT-PCR技术分析表达差异,结果表明ThZF1受干旱和盐的诱导。GFP融合瞬时表达实验显示它定位于细胞核。 ThZF1有激活酵母HIS基因的作用,凝胶阻滞分析表明ThZF1能特异结合EP2元件序列。所有这些结果说明,ThZF1可能是一个EP2结合型转录因子,暗示它是一个潜在的植物转录因子。烟草瞬时表达实验表明,ThZF1能诱导AtEPSP1:GUS的表达,说明它可能直接作用于EPSPs类下游基因的启动子而调控后者的表达。 为了进一步研究ThZF1的功能,用农杆菌介导法将其基因转入拟南芥,得到转基因的拟南芥azf2突变体互补植株,并研究了转基因互补植株与突变体和野生对照的生长以及对盐和干旱的耐受性差异。结果表明,转基因的植株在缺少水分时开花较早;离体叶片失水较慢,表现较好的保水能力;另外,在转基因互补植株中,可能的下游基因AtEPSP1的表达受到诱导。由于EPSPs类基因参与莽草酸代谢途径,并且与逆境胁迫密切相关,因此JThZF1可能通过这种方式影响了植物的生长发育并提高了逆境耐受性。 本研究首次从盐生模式植物小盐芥幼苗叶片中克隆了一个C2H2类的锌指蛋白基因,并对其性

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Abstract

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第一章 文献综述

1.1 盐胁迫和植物耐盐机理的研究进展

1.1.1 盐胁迫下植物的信号转导途径与应答基因

1.1.2 植物的盐耐受性反应

1.1.3 植物耐盐基因工程

1.2 小盐芥的研究背景

1.2.1 盐胁迫的研究中的模式植物

1.2.2 选择小盐芥

1.3 转录因子研究背景

1.3.1 植物转录因子的结构

1.3.2 转录因子研究方法

1.3.3 逆境信号传导过程中的转录因子

1.4 锌指蛋白研究进展

1.4.1 锌指蛋白的结构特点及分类

1.4.2 植物TFⅢA类型锌指蛋白

1.4.3 植物TFⅢA类型锌指蛋白的功能

1.5 基因克隆的策略及RACE技术介绍

1.5.1 EST策略

1.5.2 RACE技术

第二章 小盐芥锌指蛋白ThZF1基因的克隆

2.1 前言

2.2 材料

2.2.1 植物材料和E.coli菌株

2.2.2 质粒载体及涉及序列

2.2.3 PCR引物

2.2.4 工具酶及分子量标准

2.2.5 试剂盒

2.2.6 杂交膜及放射性同位素

2.2.7 主要化学试剂

2.2.8 主要仪器

2.2.9 DNA和蛋白质序列分析软件

2.3 方法

2.3.1 组织总RNA提取(小量法)

2.3.2 总RNA质量及浓度测定

2.3.3 RT-PCR

2.3.4 RACE方法

2.3.5 PCR产物的纯化和回收

2.3.6 连接反应

2.3.7 感受态细胞的制备

2.3.8 重组质粒的转化

2.3.9 质粒DNA的提取

2.3.10 酶切反应

2.3.11 PCR产物及酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测

2.3.12 DNA序列测定

2.3 结果与分析

2.3.1 RNA的质量检测结果

2.3.2 ThZF1中间片段的获得

2.3.3 3'RACE片段的获得

2.3.4 5'RACE片段的获得

2.3.5 全序列的拼接与分析

2.4 讨论

2.4.1 ThZF1 cDNA的克隆

2.4.2 ThZF1属于ZPT亚家族成员

第三章 ThZF1的表达特性分析

3.1 材料与方法

3.1.1 植物材料

3.1.2.方法

3.3 结果与分析

3.3.1 干旱和盐胁迫诱导了ThZF1基因的表达

3.3.2 ThZF1-GFP融合蛋白的亚细胞定位

3.4 讨论

第四章 ThZF1的转录因子功能分析

4.1 转录激活活性分析

4.1.1 载体构建

4.1.2 酵母感受态细胞的制备

4.1.3 酵母热击转化

4.1.4 阳性克隆的筛选

4.1.5 结果与分析

4.1.6 相关溶液配制

4.2 烟草瞬时表达分析

4.2.1 载体构建

4.2.2 阳性农杆菌的制备和转化

4.2.3 瞬时表达及GUS活性分析

4.2.4 结果与分析

4.3 DNA结合功能分析

4.3.1 载体构建

4.3.2 蛋白表达和纯化

4.3.3 探针制备

4.3.4 凝胶阻滞分析

4.3.5 结果

4.4 讨论

第五章 转ThZF1基因拟南芥耐盐耐旱性研究

5.1 材料

5.1.1 植物材料及胁迫处理

5.1.2 工程菌与质粒载体

5.1.3 工具酶及主要试剂

5.1.4 常用培养基

5.2 方法

5.2.1 重组表达载体的构建与鉴定

5.2.2 农杆菌的转化

5.2.3 农杆菌介导的拟南芥转化(真空渗入法)

5.2.4 基因组DNA的提取(SDS法)

5.2.5 阳性株的鉴定

5.2.6 转基因拟南芥的离体叶片的失水速率测定

5.3 结果与分析

5.3.1 真核表达载体pCAMBIA1301-ThZF1构建与鉴定

5.3.2 农杆菌介导的拟南芥转化

5.3.3 转基因拟南芥的鉴定

5.3.4 转基因拟南芥的表型分析

5.3.5 转基因拟南芥的离体叶片的干旱分析

5.3.6 ThZF1的下游基因表达分析

5.4 讨论

第六章 结论

参考文献

常用培养基和溶液的配制

致谢

作者简历

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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