论文摘要
碱性淀粉酶是一种在碱性环境（pH9.011.0）下稳定且可以通过裂解α-1,4-糖苷键高效水解淀粉的水解酶。碱性淀粉酶可以应用于纺织退浆、洗涤剂添加等领域。研究发现，碱性淀粉酶在纺织退浆领域中应用可以节省大量时间、降低环境污染，同时可以将对纺织织物本身造成的损坏降至最低程度。这极大提高了纺织物前处理过程中的效率，实现最大生产经济效益，是推动未来纺织物前处理工艺快速发展的关键酶制剂之一。国内外对碱性淀粉酶的研究主要集中在生产菌株筛选、酶的分离纯化和酶学性质研究方面。碱性淀粉酶在纺织退浆工艺和洗涤剂添加过程中应用时，需要碱性淀粉酶具有强耐氧化特性和高催化效率。但野生型碱性淀粉酶的耐氧化性能差，催化效率低，需要通过分子改造提高其耐氧化性能及催化效率。本论文实现了碱性淀粉酶基因（Accession No. AY268953）分别在大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中的异源表达，并在此基础上通过对碱性淀粉酶进行分子改造提高了其耐氧化特性和催化效率。主要结果如下：1.根据不同宿主密码子偏好性分别优化了碱性淀粉酶密码子，并在宿主E. coli、B.subtilis、P. pastoris中成功表达。纯化后，测定碱性淀粉酶动力学参数，分析发现该酶的催化效率与已报道其他碱性淀粉酶相比较偏高，适合进一步应用研究。碱性淀粉酶的最适反应pH值为9.5，稳定pH范围为8.011.0。酶的最适反应温度为50℃，活化能（Ea）为36.1kJ/mol。酶在50和60℃温度下半衰期（t1/2）分别为15.5和3.2min，酶的熔解温度（Tm值）为64.3℃。1mM Na+对碱性淀粉酶酶活力有激活作用，但其他金属离子对酶活力均没有促进作用。非离子表面活性剂对碱性淀粉酶稳定性影响较小，但阴离子表面活性剂SDS（十二烷基硫酸钠）可完全抑制酶的活性。液态洗涤剂和固态皂类洗涤剂对碱性淀粉酶酶活力抑制作用较强，但固态洗衣粉对酶活力影响较小。2.通过在线模拟软件Swiss Model对碱性淀粉酶AmyK进行同源模拟，获得碱性淀粉酶3-D结构。分析酶3-D结构后，确定了活性位点周围5个关键甲硫氨酸残基（Met145、Met214、Met229、Met247、Met317）。采用单点突变方式，将关键氨基酸分别突变成亮氨酸后，突变体耐氧化性显著提高，但仅突变体M247L催化效率有提高。同时，突变体M247L的pH稳定性和热稳定性增强。单点突变对酶表面活性剂耐受性没有显著影响。突变体M247L与商业洗涤剂（洗衣粉）的兼容性增强。复合突变后，突变体的耐氧化性显著提高，特别是含有Met247位点突变方式产生的突变体。复合突变体M145-214L、M145-214-229L、M145-229-247L、M214-229-247L、M145-214-229-317L的底物结合能力加强。3.基于同源模拟获得的3-D结构，通过单点突变方式分别将5个关键氨基酸突变成苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸、异亮氨酸。突变体的耐氧化性显著增强。突变体M247T、M145I、M229T的kcat/Km值分别提高至改造前酶的1.3、1.5和2.1倍。通过对单点突变体耐氧化和催化效率变化综合分析，确定了8种正向单点突变方式（M145A、M145I、M214A、M229A、M229T、M247T、M247L、M317I）。通过上述8种突变方式系统进行复合突变，共获得8个五点突变体。其中，M145I-214A-229T-247T-317I的酶学性质提高最为显著：kcat/Km值提高为改造前酶的3.2倍；耐氧化性、耐碱性、热稳定性、表面活性剂稳定性和固态洗涤剂兼容性均增强。4.将6条具有不同性质的寡肽与碱性淀粉酶N端分别融合后，在宿主E. coli BL21（DE3）中成功表达。融合寡肽1（AEAEAKAKAEAEAKAK）后，AmyK::OP1的比酶活提高为融合前酶的2.4倍。融合蛋白的Km值均减小，说明酶底物结合能力增强。AmyK::OP1的kcat值提高为融合前酶的3.4倍；同时，AmyK::OP1的kcat/Km值提高为融合前酶的5.4倍。融合后，融合蛋白的耐碱性增强。寡肽1、3、4或5与碱性淀粉酶融合表达后，酶的最适反应温度提高。融合蛋白AmyK::OP1的热稳定性和耐氧化性增强。洗衣粉对AmyK::OP1的酶活力具有激活作用；同时，其他融合蛋白与洗衣粉的兼容性也较高。融合蛋白在固态皂类和液态洗涤剂存在条件下稳定性均较低。5.基于对碱性淀粉酶结构区域和氨基酸序列解析，确定了12种酶C端或N端不同截断方式，并在截断突变体N端融合表达寡肽1，共产生了24个突变体。碱性淀粉酶C端或N端截断后，突变体AmyKΔC500-587和AmyKΔC492-587的比酶活分别提高为截断前酶的3.2和2.7倍。AmyKΔC500-587和AmyKΔC492-587的kcat值均提高为截断前酶的2倍。AmyKΔC500-587和AmyKΔC492-587的kcat/Km值分别提高为截断前酶的3.4和2.6倍。截断后N端寡肽融合突变体AmyKΔC500-587::SOP和AmyKΔC492-587::SOP的kcat/Km值分别提高为截断融合前酶的29.7和22.5倍。C端淀粉结合区域对碱性淀粉酶降解玉米淀粉具有重要意义，但N端序列截断对碱性淀粉酶降解玉米淀粉能力没有影响。寡肽1融合表达对C端截断突变体降解玉米淀粉具有促进作用，但对N端截断突变体降解玉米淀粉的能力基本没有影响。随机截断和截断后融合表达对碱性淀粉酶pH稳定性和温度稳定性几乎没有影响。突变体AmyKΔC500-587、AmyKΔC492-587、AmyKΔC500-587::SOP、AmyKΔC492-587::SOP的耐氧化性增强。随机截断和截断后融合表达对碱性淀粉酶表面活性剂稳定性没有显著影响。突变体AmyKΔC500-587、AmyKΔC492-587、AmyKΔC500-587::SOP、AmyKΔC492-587::SOP与固态洗涤剂（洗衣粉）的兼容性增强。