拟南芥AtJ70的组织定位和亚细胞定位

论文摘要

J-蛋白是一个包含J-结构域的蛋白质家族,它的一些成员具有分子伴侣的功能。基因组序列分析表明,拟南芥中有90多种J-蛋白基因,其中大多数基因的功能还不知道。AtJ70是拟南芥J-蛋白家族的成员之一,关于它的特性、定位及功能还未见任何报道。本课题利用GUS和GFP报告基因的方法,研究AtJ70的组织特异性表达及亚细胞中的定位,旨在为AtJ70功能的研究提供线索和依据。用PCR的方法获得了AtJ70基因的启动子,构建了双元载体pCAMBIA1300 AtJ70 promoter:GUS,利用浸花法转化野生型拟南芥,获得了携带AtJ70 promoter:GUS融合基因的纯合体株系。对转基因植株的不同器官进行了GUS染色,结果表明:除了茎、花药、种子不被染色外,其它器官（根、叶、雌蕊、花丝、长角果）中AtJ70都有表达,其中维管组织及顶端分生组织表达较强。对不同发育时期的转基因幼苗进行GUS染色,结果发现:3d、7d、10d的小苗中都有表达,其中7d的苗表达最强。对转基因植株不同时期的叶片、花染色发现,各个时期都有表达,但是随着植株的衰老,GUS着色逐渐变浅,表明AtJ70表达量下降。软件分析表明,AtJ70可能定位在细胞核中。本课题旨在通过转基因实验验证这一分析结果。用RT-PCR的方法获得了AtJ70基因的编码区序列,构建了含有融合基因AtJ70-mGFP4的双元载体,以浸花法转化拟南芥,获得了转基因植株。利用激光共聚焦扫描显微镜观察转基因植株的根部细胞,结果表明:在转空载体的根细胞中,GFP蛋白能够在细胞内普遍分布,而转AtJ70-mGFP4的根细胞和对照差异很大,荧光只分布在细胞核中。表明AtJ70可能定位于细胞核中,与信息学分析结果一致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 文献综述
• 1 分子伴侣
• 2 热激蛋白
• 3 J-蛋白
• 3.1 J-蛋白概述
• 3.2 J-蛋白的生理功能
• 3.2.1 保护性作用
• 3.2.2 J-蛋白作为辅分子伴侣与HSP70 组成分子伴侣机器
• 3.2.3 J-蛋白参与信号转导过程
• 3.2.4 J-蛋白对环境刺激的反应及其他作用
• 3.3 拟南芥中J-蛋白研究
• 4 葡糖苷酸酶（GUS）
• 4.1 葡糖苷酸酶（Gus）的简述
• 4.2 葡糖苷酸酶（Gus）在植物分子生物学中的应用
• 5 绿色荧光蛋白
• 5.1 绿色荧光蛋白及其发光特性
• 5.2 GFP 作为报告基因在分子生物学研究中的应用
• 材料和方法
• 1 实验材料
• 2 实验试剂和设备
• 3 实验方法
• 3.1 拟南芥的种植
• 3.2 植物基因组DNA 小量提取
• 3.3 RNA 的提取
• 3.4 质粒DNA 的小量提取（碱裂解法）
• 3.5 PCR 扩增目的片断
• 3.6 目的片段的亚克隆及鉴定
• 3.7 DNA 酶切
• 3.8 DNA 片段的回收
• 3.9 DNA 片段的连接
• 3.10 DNA 琼脂糖电泳
• 2 法细菌感受态细胞的制备'>3.11 CaCl₂法细菌感受态细胞的制备
• 3.12 细菌转化
• 3.13 农杆菌感受态细胞的制备
• 3.14 农杆菌的转化及鉴定
• 3.15 拟南芥的遗传转化及筛选
• 3.16 GUS 染色
• 结果与分析
• 1 ATJ70 基因组织特异性表达
• 1.1 AtJ70 基因启动子的获得
• 1.2 pCAMBIA1300 AtJ70 promoter : GUS 双元载体的构建
• 1.3 拟南芥遗传转化及转基因植株DNA 水平的鉴定
• 1.4 AtJ70 基因的时空表达
• 1.4.1 AtJ70 基因在不同器官的表达情况
• 1.4.2 AtJ70 基因在不同发育时期的表达
• 2 ATJ70 基因的亚细胞定位
• 2.1 AtJ70 基因的获得
• 2.2 pBIN AtJ70-mGFP4 的构建
• 2.3 拟南芥遗传转化及转基因植株DNA 水平的鉴定
• 2.4 AtJ70 的亚细胞定位
• 讨论
• 1 组织特异性表达研究
• 2 亚细胞定位的研究
• 结论
• 参考文献
• 缩写表
• 附录
• 致谢