论文摘要
随着社会经济的发展和人们生活方式的改变,肥胖的发生率逐年上升,已经成为世界范围内的公共卫生问题。肥胖不仅仅是脂肪组织的过度聚集,同时与2型糖尿病、动脉粥样硬化、高血压和脂肪肝等慢性病密切相关。高脂饮食是肥胖发生的重要危险因素,但是高脂饮食条件下,并不是所有的个体都发生肥胖,而一部分发生肥胖,而另外一部分表现出了肥胖抵抗,目前相关的机制还未完全阐明。最近研究发现,高脂饮食与下丘脑炎性反应密切相关。下丘脑炎性因子表达的增加可以导致胰岛素和瘦素抵抗,从而引起机体的摄食紊乱和体重的增加。Toll样受体-4 （Toll like receptor 4, TLR4）作为保守的模式识别受体,在机体的免疫调控中有着重要作用。脑室注入饱和脂肪酸可以显著增加下丘脑TLR4和相关炎性基因的表达,TLR4抗体干预可逆转高脂饮食诱导的下丘脑炎性反应和胰岛素抵抗并降低食物的摄入量。核因子-κB （Nuclear factor-KB, NF-κB）作为TLR4的下游信号分子,在机体的炎性反应中起着关键的作用。最新研究发现NF-κB与下丘脑的胰岛素和瘦素抵抗也密切相关。利用外源性载体激活下丘脑的NF-κB可以引起下丘脑的胰岛素和瘦素敏感性降低,导致小鼠的摄食增加,而同样的方法抑制下丘脑NF-κB的活性后可使肥胖小鼠的摄食量降低,体重减轻。以上研究提示高脂饮食诱导的下丘脑炎性反应在机体的摄食紊乱和肥胖的发生中起着重要的作用。同样高脂饮食条件下,肥胖抵抗大鼠是否可以通过抑制下丘脑的炎性反应从而阻止肥胖的发生,目前还没有相关的报道。饮食诱导的肥胖个体通常伴随着胰岛素抵抗。但是有研究发现不同高脂饮食条件下,肥胖个体的胰岛素敏感性存在差异,富含多不饱和脂肪酸的高脂饮食可以改善肥胖个体的胰岛素敏感性。目前,相关的机制还不是很清楚。近年来,肥胖被认为是一种低度慢性炎症状态。长期低度的炎性反应可以导致外周的胰岛素抵抗,引起糖脂代谢紊乱。脂肪组织在肥胖个体伴随的炎性反应有着极其重要的作用,脂肪细胞与免疫细胞相互作用促进炎性因子分泌的增加,进一步研究发现脂肪组织中的巨噬细胞是炎性因子分泌的主要来源,伴随着巨噬细胞浸润的增加,炎性因子分泌增加。在介导巨噬细胞迁移和聚集的因素中,骨桥蛋白（osteopontin, OPN）因其较强的粘附趋化能力及在细胞迁移过程中的重要作用而备受关注。还有研究发现,高脂饮食条件下,OPN-/-小鼠与野生型小鼠相比体重无显著变化,但是胰岛素敏感性却显著增加,静脉注入OPN抗体可以明显改善饮食诱导肥胖小鼠的胰岛素敏感性。以上研究说明OPN介导的脂肪组织炎性反应在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗的发生中起着重要的作用。但OPN介导的脂肪组织炎性反应是否参与了脂肪酸类型不同高脂饮食诱导的肥胖大鼠的胰岛素敏感性差异,目前尚不清楚。为了了解炎性反应和高脂饮食诱导的肥胖易感性及胰岛素敏感性差异的关系,进一步探讨肥胖和胰岛素抵抗发生的机制,我们分别建立了肥胖和肥胖抵抗动物模型以及脂肪酸类型不同的高脂饮食诱导的肥胖动物模型,分析了不同模型中大鼠下丘脑或脂肪组织炎性基因的表达变化,同时观察了膳食干预对炎性基因表达的影响。第一部分下丘脑炎性反应和高脂饮食诱导的肥胖易感性差异关系的研究目的：建立高脂饮食诱导的肥胖和肥胖抵抗动物模型,探讨下丘脑炎性反应与高脂饮食诱导的肥胖易感性差异的关系,同时观察低脂饮食干预对大鼠体重和下丘脑炎性反应的影响。方法：雄性清洁级SD大鼠55只,适应性喂养1周之后,随机分为高脂饲料组（HF,n=45）和基础饲料对照组（CF,n=10）。基础饲料由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供；每100g高脂饲料含有基础饲料60g,猪油15g,蛋黄粉13g,干酪素10g,白糖2g。基础饲料总热能3.29kcal/g（碳水化合64.44%、蛋白质21.88%、脂肪13.68%）；高脂饲料总热能4.62kcal/g（碳水化合物30.15%、蛋白质22.00%、脂肪49.85%）。第10周时,高脂实验组大鼠体重基本稳定,参照对照组大鼠的平均体重及标准差,将高脂饲料组大鼠分为饮食诱导肥胖（Dietary induced obesity, DIO）大鼠（体重大于对照组平均体重加1.96倍标准差）和饮食诱导肥胖抵抗大鼠（Dietary induced obesity resistant, DIO-R）大鼠（体重小于对照组平均体重加1倍标准差）,体重介于二者之间的大鼠不纳入本次研究。再分别将DIO和DIO-R大鼠随机分为两组,一组继续高脂饲料喂养,一组转为基础饲料喂养,干预8周。各组大鼠自由摄食和饮水,动物房温度（20±2）℃,相对湿度（50+10）%,明暗周期12比12。每天记录进食量,每周记录体重。分别与实验开始、10周和实验结束时过夜禁食12h采集尾血,离心之后保存待测。实验结束时,大鼠断头处死,迅速分离下丘脑并置液氮冻存,24小时后转移至-80℃冰箱保存,以备RNA抽提。同时分离大鼠的肾周和睾周脂肪组织并准确称重。实时定量PCR法（Real-time PCR）检测各组大鼠TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6基因表达水平。结果：1.喂养10周后,高脂饲料组中18只大鼠判定为肥胖易感大鼠（DIO）,12只判定为肥胖抵抗大鼠（DIO-R）。DIO组大鼠的能量摄入和能量利用率显著高于DIO-R和CF组,但DIO-R组与CF组相比无统计学差异。DIO组大鼠的TC、TG、LDL-C、FBG、FINS和HOMA-IR显著高于DIO-R和CF组大鼠（P<0.05）,DIO-R大鼠的TC、LDL-C、FINS和HOMA-IR与CF组相比显著增高（P<0.05）2. DIO/HF组大鼠下丘脑TLR4、NF-κB、IL-6和IL-1β表达水平显著高于DIO-R/HF和CF组大鼠,DIO-R/HF与CF组相比（P<0.05）,下丘脑TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6表达水平没有变化。3.低脂饲料干预后,DIO/CF组大鼠的体重和脂肪蓄积量与DIO/HF组相比显著下降,DIO-R/CF的体重与DIO-R/HF组大鼠相比无变化,但脂肪蓄积量显著降低。DIO/CF和DIO-R/CF与其相应的高脂组相比,能量摄入无显著变化,能量利用率显著降低。DIO/CF组大鼠的TC、FINS和HOMA-IR与相应的高脂组相比显著降低。DIO/CF和DIO-R/CF组大鼠下丘脑TLR4、NF-κB、IL-6和IL-1β的表达水平与其相对应的高脂组相比无显著差异,DIO/CF组大鼠下丘脑炎性基因的表示仍显著高于CF组大鼠。结论：猪油配制的高脂饲料喂养10周可以诱导大鼠肥胖易感性差异的发生,高脂饮食诱导的下丘脑炎性反应可能使肥胖易感大鼠的摄食紊乱,从而导致能量摄入增加和肥胖的发生,而肥胖抵抗大鼠可以通过抑制下丘脑炎性反应保持适宜的摄食和稳定的体重。低脂饮食干预可以显著降低肥胖易感大鼠的体重和脂肪蓄积量,但对肥胖大鼠下丘脑炎性基因的表达没有影响。第二部分脂肪组织炎性反应与脂肪酸类型不同的高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰岛素敏感性差异的研究目的：建立富含饱和脂肪酸高脂饮食和富含多不饱和脂肪酸高脂饮食诱导的肥胖大鼠模型,探讨脂肪组织炎性反应与不同类型脂肪酸高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰岛素敏感性差异的关系,并观察低脂饮食干预对胰岛素敏感性和脂肪组织炎性基因表达的影响。方法：雄性清洁级SD大鼠100只,适应性喂养1周之后,随机分为猪油高脂饲料组（SF,n=45）、大豆油高脂饲料组（PF,n=45）和基础饲料对照组（CF,n=10）。基础饲料由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供；每100g高脂饲料含有基础饲料60g,猪油/大豆油15g,蛋黄粉13g,干酪素10g,白糖2g。基础饲料总热能3.29kcal/g（碳水化合64.44%、蛋白质21.88%、脂肪13.68%、）；高脂饲料总热能4.62kcal/g（碳水化合物30.15%、蛋白质22.00%、脂肪49.85%）。第10周时,高脂实验组大鼠体重基本稳定,参照对照组大鼠的平均体重及标准差,分别筛选出富含饱和脂肪酸高脂饲料诱导的肥胖大鼠（Saturated fat diet induced obesity, SF-DIO）和富含多不饱和脂肪酸诱导的肥胖大鼠（polyunsaturated fat diet induced obesity, PF-DIO）大鼠。再分别将SF-DIO和PF-DIO大鼠随机分为两组,一组继续高脂饲料喂养,一组转为基础饲料喂养,继续喂养8周。实验期间,各组大鼠自由摄食和饮水,动物房温度（20+2）℃,相对湿度（50±10）%,明暗周期12比12。每天记录进食量,每周记录体重。分别与实验开始、10周和实验结束时过夜禁食12h采集尾血,离心之后保存待测。实验结束后,大鼠断头处死,迅速分离出大鼠肾周与睾周脂肪组织,准确称重后置液氮快速冷冻,-80℃冰箱保存待测。酶联免疫法和免疫印记法（Western Blotting）分别检测大鼠血清和脂肪组织OPN蛋白表达；实时定量PCR法（Real-time PCR）检测各组大鼠OPN、NF-κB、IL-6和IL-10基因表达水平。结果：1.猪油高脂饲料和大豆油高脂饲料组大鼠的肥胖发生率分别为42.2%（SF-DIO）和48.9%（PF-DIO）,两组大鼠肥胖发生率无显著差异。SF-DIO组大鼠的FBG、FINS和HOMA-IR显著高于PF-DIO组大鼠和CF组大鼠（P<0.05）；PF-DIO组大鼠的FINS和HOMA-IR显著高于CF组,而FBG在两组间的差异无显著性。2. SF-DIO/SF大鼠脂肪组织OPN的基因和蛋白表达水平以及NF-κB和IL-6的基因表达水平显著高于PF-DIO/PF和CF组大鼠,同时,PF-DIO/PF组OPN、NF-κB和IL-6的表达水平也显著高于CF组,SF-DIO/SF和PF-DIO/PF组大鼠脂肪组织IL-10表达无差异,并显著低于CF组大鼠。3.低脂干预以后,SF-DIO/CF和PF-DIO/CF组大鼠的体重和脂肪蓄积量与相应的高脂组相比显著下降,能量摄入无显著变化。同时,SF-DIO/CF的FINS和HOMA-IR与SF-DIO/SF组相比显著降低,PF-DIO/CF的HOMA-IR与PF-DIO/PF组相比显著降低。SF-DIO/CF和PF-DIO/CF组大鼠脂肪组织OPN的基因和蛋白表达以及NF-κB和IL-6的基因表达与其相应的高脂组相比显著降低,但SF-DIO/CF组脂肪组织OPN和NF-κB表达水平仍显著高于PF-DIO/CF与CF组大鼠,PF-DIO/CF与CF组相比无显著差异,SF-DIO/CF和PF-DIO/CF组大鼠脂肪组织的IL-10的表达出现了增加的趋势,但与其相应的高脂组相比,差异无显著意义,仍显著低于基础饲料对照组大鼠。血清OPN含量在各个组间无统计学差异。结论：能量密度相同而脂肪酸类型不同的高脂饲料对SD大鼠具有相同的肥胖诱导作用,但是对肥胖大鼠的胰岛素敏感性具有不同的影响。饱和脂肪酸高脂饮食通过上调OPN的表达,促进脂肪组织炎性反应从而诱导肥胖大鼠的胰岛素抵抗；而多不饱和脂肪酸高脂饮食则可以抑制脂肪组织OPN的表达,降低脂肪组织炎性反应从而改善肥胖大鼠的胰岛素敏感性。低脂饮食干预可以增强肥胖大鼠的胰岛素敏感性并降低脂肪组织炎性基因的表达。创新性：1.首次探讨了高脂饮食诱导的肥胖和肥胖抵抗大鼠下丘脑炎性基因表达的变化并进一步观察了低脂饮食干预对不同肥胖易感性大鼠下丘脑炎性表达的影响,为继续探讨肥胖发生的机制及预防和治疗途径提供了新的思路和方法。2.首次针对性的探讨了脂肪组织炎症与脂肪酸类型不同高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰岛素敏感性差异的关系,为预防和改善胰岛素抵抗提供了一条新的途径,同时观察了低脂饮食干预后炎性基因表达的变化,进一步阐明了脂肪酸的含量和类型对肥胖大鼠胰岛素敏感性的影响。
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