草莓miR156靶基因SPL9的克隆及表达分析

论文摘要

SPL基因家族是植物所特有的一个基因家族,也是miR156作用的靶基因,其编码的蛋白是一种转录因子,对植物花和果实的发育、植株形态建成、孢子发生、胁迫应答、激素信号转导以及植物阶段转变等多种生理生化过程都有一定的作用。近年来已经从拟南芥,玉米,水稻,葡萄,辣椒,枳等多种植物中分离出SPL基因,但对其功能的研究一直局限在拟南芥等模式植物中。本文首次克隆了草莓SPL基因全长,并利用实时定量PCR技术研究了FaSPL9、miR156以及miR172在草莓实生苗和组培苗发育不同时期的表达差异,为进一步研究植物阶段转变机理及草莓组培苗“返童”机理奠定基础。主要研究结果如下：1.利用简并引物采用同源克隆的方法从草莓中分离出5条SPL基因片段,其长度分别为120 bp,141 bp,342 bp,544 bp,773 bp,其中两个包含miRl56靶序列,它们与拟南芥或者苹果SPL基因的同源性达到78%以上。2.通过3’RACE和5’RACE试验从草莓中分离出了1条SPL基因cDNA全长序列,其与拟南芥AtSPL9同源性最高,所以将其命名为FaSPL9。FaSPL9的cDNA全长为1337 bp,CDS长1143 bp,编码381个氨基酸,包含一个由79个氨基酸残基组成的高度保守的SBP结构域。3.利用在草莓‘全明星’中获得的FaSPL9基因序列设计引物,在草莓栽培品种‘丰香’、‘图得拉’、‘阿尔比’、‘枥乙女’、‘红颜’以及优系08-4.1中都分离出了FaSPL9基因片段,它们都包含了miR156靶序列,核酸序列同源性为99.18%,氨基酸序列同源性为98.73%。4.利用实时定量RT-PCR检测了miR156和FaSPL9在草莓实生苗和组培苗不同发育时期的表达,以及miR172在草莓组培苗不同发育时期的表达,表明miR156的表达量在实生苗和组培苗中都呈现随着苗龄增长而降低的趋势,FaSPL9在实生苗中的表达量随着苗龄增长而上升,miR172在组培苗中的表达量呈现随着苗龄增长而上升的趋势。5.利用快速定点突变技术对FaSPL9基因进行改造,获得了miR156靶位点消除但所翻译氨基酸序列不变的FaSPL9突变体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 植物miRNA的研究进展
• 1.1.1 植物miRNA的生物学功能
• 1.1.2 miRNA对靶位点的识别及其作用机制
• 1.2 SBP类转录因子的研究进展
• 1.2.1 SBP转录因子的结构
• 1.2.2 SBP类转录因子的功能
• 1.2.3 SBP家族的调控
• 1.3 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 草莓总RNA的提取
• 2.2.2 RNA的质量及纯度检测
• 2.2.3 草莓SPL基因片段的分离
• 2.2.4 草莓SPL9全序列的克隆
• 2.2.5 草莓不同品种中SPL基因的分离
• 2.2.6 PCR特异片段的回收与重组连接
• 2.2.7 重组质粒DNA的转化、鉴定及测序
• 2.2.8 序列分析
• 2.2.9 实时定量RT-PCR
• 2.2.10 草莓SPL9基因的定点突变
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA的质量以及完整性
• 3.1.1 RNA的完整性
• 3.1.2 RAN的纯度
• 3.2 草莓SPL基因片段的分离
• 3.2.1 PCR扩增特异片段
• 3.2.2 草莓SPL特异片段序列分析
• 3.3 草莓SPL基因cDNA全长的获得
• 3.3.1 cDNA全序列的获得
• 3.3.2 草莓SPL9基因的序列分析
• 3.4 不同草莓品种SPL9基因片段的比较
• 3.5 SPL与miR156在草莓不同生长阶段的表达
• 3.5.1 不同时期SPL9基因的RT-PCR检测
• 3.5.2 不同时期miR156以及miR172的检测
• 3.5.3 miR156以及SPL9在草莓实生苗中的表达
• 3.5.4 miR156、SPL9以及miR172在草莓组培苗中的表达
• 3.6 草莓SPL9基因的定点突变
• 3.6.1 质粒提取及检测
• 3.6.2 突变质粒的获得及分析
• 4 讨论
• 4.1 草莓SPL9基因克隆
• 4.2 实时定量RT-PCR以及miRNA的检测
• 4.3 FaSPL9作为miR156的靶基因在植物阶段转变中的作用
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文