基于MDCK的葛根素跨膜转运机制的研究

论文摘要

MDCK（Madin-Darby Canine Kidney）是马丁达比犬的肾近区小管上皮细胞，它和Caco-2是目前应用于体外跨膜转运研究的两个最主要的单层细胞模型。和Caco-2一样，MDCK接种在半透膜上之后能分化成柱状单层上皮并形成致密的连接。此外，MDCK还具有生长快和细胞亚型少的优势，这使得实验周期能够大大缩短并且实验结果重现性较高。P-gp（P-糖蛋白，P-glycoprotein）广泛存在于人体各组织细胞中，可能量依赖性的将细胞内药物泵出到细胞外，导致药物透膜吸收减少，血药浓度降低。维拉帕米（verapamil）是P-gp的常用抑制剂。葛根素（Puerarin），又名普乐林，是从中国传统中药葛根中提取出的一种异黄酮类化合物，是中药葛根的主要活性成分。葛根素具有多种而复杂的药理作用，比如降血压、降血脂、降血糖、抑制血小板聚集、抗氧化、抗炎、抗心律失常、舒张心脑血管和神经保护作用等。葛根素的药理作用明确，资源丰富，价格低廉，临床应用前景广阔。葛根素的口服利用度比较低，现在对于葛根素的药剂学研究重点方向是提高其生物利用度。本实验的目的是建立MDCK单层模型和葛根素的HPLC测定方法，分析了浓度、方向、温度和P-gp抑制剂维拉帕米（verapamil）对葛根素跨膜转运过程的影响，对于提高葛根素的口服生物利用度相关研究具有一定的指导意义。具体研究工作如下：第一部分建立葛根素HPLC的测定方法采用HPLC法，Shim-pack ODS色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），柱温40℃。流动相A为甲醇，B相为0.2%（v/v）磷酸水溶液（PH用三乙胺调为3.5），以A:B=30:70（v/v）进行液相洗脱，检测波长250nm，流速1.0mL·min-1，进样20μL。在此条件下，葛根素线性良好（R2>0.9999，n=7），日内精密度≤0.61%，日间精密度≤2.13%。第二部分MDCK细胞模型的建立将MDCK按5×104个细胞/cm2接种在Millicell-CM Hanging Culture PlateInserts上培养至细胞生长分化成细胞单层，用Millicell-ERS测量细胞单层的电阻值以确定细胞单层的完整性和致密性。只有电阻值大于140·cm2的细胞单层才可使用。第三部分不同条件下葛根素的跨膜转运实验用HEPES浓度为10mmol· L-1的Hanks溶液作为转运媒介进行葛根素跨膜转运实验。对葛根素浓度、转运方向、转运环境温度和有无P-gp的抑制剂分别进行考察。80μg mL-1葛根素在37℃和4℃下，A→B方向上的Papp分别是（2.36±0.12）×10-6和（6.10±0.36）×10-7cm/s，而在B→A上则分别为（9.24±0.75）×10-7和（2.14±0.25）×10-7cm/s。37℃下当加入维拉帕米之后80μg mL-1葛根素的吸收Papp上升到（5.74±0.28）×10-6cm/s。结果发现：葛根素的转运速率和透过量随浓度的增加而上升；不同转运方向的结果有明显不同；温度降低之后，转运速率和透过量明显下降；加入P-gp的抑制剂维拉帕米之后，转运速率和转运量上升。以上提示，葛根素的跨膜过程有多种转运机制参与，不仅包括被动扩散还有能量依赖的转运，P-gp蛋白对葛根素的吸收有抑制作用，或许这是葛根素口服吸收生物利用度较低的原因。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 建立葛根素 HPLC 的测定方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 药品和试剂
• 1.1.2 仪器与设备
• 1.2. 实验方法和结果
• 1.2.1 葛根素标准溶液的配制
• 1.2.2 色谱条件
• 1.2.3 实验方法学考察
• 1.2.3.1 葛根素的线性考察
• 1.2.3.2 稳定性考察
• 1.2.3.3 精密度和准确度考察
• 1.3. 讨论
• 第二部分 MDCK 细胞模型的建立
• 2.1. 实验材料
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 材料、试剂与仪器
• 2.2. 实验方法
• 2.2.1 MDCK 的传代与消化
• 2.2.2 将 MDCK 接种到 Millicell-CM CPI 上
• 2.2.3 MDCK 模型的形态学检查
• 2.2.4 细胞 TEER 的测定和计算
• 2.2.4.1 细胞 TEER 的测定
• 2.2.4.2 细胞 TEER 的计算
• blank)和细胞单层的电阻值(R_{cell monolayer})'>2.2.4.2.1 确定孔板的电阻值(R_blank)和细胞单层的电阻值(R_{cell monolayer})
• 2.4.2.2.2 确定单位面积的电阻值（Unit Area Resistance）
• 2.3. 实验结果
• 2.3.1 MDCK 形态学检查
• 2.3.2 TEER 的测量结果
• 第三部分 不同条件下葛根素的跨膜转运实验
• 3.1. 实验材料
• 3.1.1 细胞株
• 3.1.2 材料、试剂与仪器
• 3.2. 不同条件下 puer 在 MDCK 模型上的跨膜转运实验
• 3.2.1 不同浓度 Puer 在 MDCK 模型上吸收研究（A→B）
• 3.2.2 80μg/ml Puer 在 MDCK 模型上的分泌研究（B→A）
• 3.2.3 80 μg/ml Puer 在 4℃下的吸收和分泌
• -1的 Puer 跨膜吸收的影响'>3.2.4 P-gp 抑制剂 Ver 对 80 μg mL^-1的 Puer 跨膜吸收的影响
• 3.3. 实验结果
• 3.3.1 不同浓度 puer 在 MDCK 模型上的吸收研究(A→B
• 3.3.2 80μg/ml puer 在 MDCK 模型上的分泌研究（B→A）
• 3.3.3 80μg/ml puer 在 4℃下的吸收和分泌
• -1的 Puer 跨膜吸收的影响'>3.3.4 P-gp 抑制剂 Ver 对 80 μg mL^-1的 Puer 跨膜吸收的影响
• 3.4. 讨论
• 小结
• 附录
• 1. 个人简历
• 2. 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 综述
• 参考文献