多氯联苯降解酶的分离纯化及酶学性质研究

论文摘要

多氯联苯（polychlorinated biphenyls, PCBs）作为一种持久性污染物,对环境及环境内生物的危害早已不容忽视。环境中多氯联苯污染的微生物修复,一直是国内外研究的热点问题。不少研究学者从受多氯联苯污染的环境筛选出具有降解多氯联苯作用的菌株,但在多氯联苯降解酶的提取及其性质分析上却少有报道。本论文旨在从表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）中分离纯化出多氯联苯降解酶,研究其酶学性质,并探讨该菌株对联苯降解的途径。将本实验筛选并保藏的表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）在30℃振荡培养20h,8000rpm离心收集菌体,缓冲溶液洗涤悬浮,在冰浴中超声破碎得粗抽提液。粗抽提液经硫酸铵分级盐析、透析脱盐、SephadexG-150分子筛柱层析得到纯的多氯联苯降解酶。以联苯为底物,分析多氯联苯降解酶的酶学性质,其最佳的作用条件为：40℃、pH 7.0。在pH值为6.0-9.0,温度在30-60℃时,该酶稳定性好。多氯联苯降解酶的米氏常数Km值为4.96mmol/L,最大反应速度Vm为2.03mmol/（L·min）。同时测定了部分金属离子对多氯联苯降解酶酶活力的影响。铜离子和铁离子对酶活力影响最大,起到了一定的抑制作用；钾离子、镁离子、钙离子、锌离子对酶活力影响不大；钠离子和铝离子对酶活力可能有一定的激活作用。采用紫外可见分光光度法与气相色谱-质谱联用法相结合的方式来分析降解过程中的几种酶及降解过程的中间产物,依此来探讨分析表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）对联苯降解的途径。依据紫外可见分光光度法和GC-MS法测定的结果,推断表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）对联苯降解的途径为典型的好氧PCBs/联苯降解途径：联苯经过联苯双加氧酶催化氧化生成2,3-二氢二羟基联苯；2,3-二氢二羟基联苯在2,3-二氢-2,3-二羟基联苯脱氢酶的作用下,脱去两个氢,得到2,3-二羟基联苯；经过2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶的催化裂解,2,3-二羟基联苯的一个苯环被打开,生成黄色开环物质2-羟基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸（HOPDA）;2-羟基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸在HOPDA水解酶作用下生成苯甲酸。本实验所分离得到一种活力强、常温下催化速率大、稳定性高的多氯联苯降解酶,其收率达30.56%,可用于环境中多氯联苯环境污染的生物修复。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 PCBs的概述
• 1.1.1 PCBs的结构和性质
• 1.1.2 PCBs的危害
• 1.2 PCBs的污染现状
• 1.2.1 PCBs的来源
• 1.2.2 水环境污染现状
• 1.2.3 大气环境污染现状
• 1.2.4 土壤环境污染现状
• 1.2.5 沉积物环境污染现状
• 1.3 PCBs污染修复的现状
• 1.3.1 PCBs的研究现状
• 1.3.2 PCBs的修复方法
• 1.3.3 PCBs的微生物修复
• 1.3.4 PCBs降解菌
• 1.3.5 PCBs降解酶
• 1.4 本课题内容构成
• 1.4.1 课题的研究目的和意义
• 1.4.2 课题的研究内容和技术路线
• 第二章 PCBs降解酶的分离纯化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试菌种
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.1.4 溶液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌体发酵
• 2.2.2 生长曲线
• 2.2.3 粗抽提液的制备
• 2.2.4 蛋白质含量的测定方法
• 2.2.5 酶活力的测定
• 2.2.6 硫酸铵分级盐析
• 2.2.7 透析脱盐和真空冷冻干燥
• 2.2.8 Sephadex G-150柱层析
• 2.2.9 样品的浓缩
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 生长曲线
• 2.3.2 粗抽提液的制备
• 2.3.3 硫酸铵分级盐析
• 2.3.4 Sephadex G-150柱层析
• 2.3.5 酶的纯化结果
• 2.4 本章小结
• 第三章 PCBs降解酶的酶学性质
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 酶最适pH值的测定
• 3.2.2 酶的pH稳定性
• 3.2.3 酶的最适反应温度
• 3.2.4 酶的热稳定性
• 3.2.5 金属离子对酶活性的影响
• 3.2.6 酶的米氏常数Km的测定
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 酶的最适pH
• 3.3.2 酶的pH稳定性
• 3.3.3 酶的最适反应温度
• 3.3.4 酶的热稳定性
• 3.3.5 金属离子对酶活性的影响
• 3.3.6 酶的米氏常数Km的测定
• 3.4 本章小结
• 第四章 表皮葡萄球菌的联苯降解途径研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 实验仪器
• 4.1.3 溶液配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 降解途径中相关酶的测定
• 4.2.2 表皮葡萄球菌的联苯降解的产物分析
• 4.2.3 气相色谱-质谱联用分析条件
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 降解途径中相关酶的测定
• 4.3.2 表皮葡萄球菌的联苯降解产物分析
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 附录Ⅰ 调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25℃）
• 附录Ⅱ Sephadex G型交联葡聚糖凝胶溶胀时间
• 附录Ⅲ 缓冲溶液的配制方法表
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文及专利