论文摘要
第一部分利用Helper Free系统构建携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒及功能鉴定目的周期素依赖性蛋白激酶（cyclin dependent kinases, cdks）在多种神经变性疾病的发病中扮演着重要的角色。实验目的是为了探讨与cdks相关的基因治疗C型尼曼-皮克病的可能性,我们包装携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus, rAAV）。方法应用分子生物学技术构建生成pAAV-EGFP-U6-cdc2-siRNA表达质粒。用磷酸钙将该质粒和p-RC、p-Helper质粒共转染于AAV-293细胞中,包装生成携带cdc2-siRNA的rAAV （rAAV-EGFP-U6-cdc2-siRNA）。行Western Blot检测cdc2-siRNA对AAV-293细胞cdc2基因的沉默效果。结果DNA测序证明U6-cdc2-siRNA已成功构建到质粒pAAV-MCS-EGFP中。经72小时的包装,AAV-293细胞中可见EGFP的表达。rAAV-EGFP-U6-cdc2-siRNA感染AAV-293细胞后,经Western Blot检测显示AAV-293细胞中cdc2基因表达显著下调,这证明该重组腺相关病毒具有令人满意的基因沉默作用。结论这些结果表明该携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装获得成功。它具有有效沉默cdc2基因的作用,这将可能为C型尼曼-皮克病提供一种新的治疗手段。第二部分携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒对C型尼曼-皮克病小鼠行为学的影响目的观察小脑注射携带cdc2-小干扰RNA（cdc2-siRNA）重组腺相关病毒（rAAV）对C型尼曼-皮克病（NPC）小鼠行为学的影响。方法2周龄npc-/-小鼠经小脑注射携带cdc2-siRNA的rAAV,动态测量小鼠体重,并进行衣架悬挂试验及足印试验评估小鼠4到8周的运动能力。结果①cdc2-siRNA组小鼠体重减轻明显延缓。②衣架悬挂试验显示cdc2-siRNA组小鼠运动缺陷明显改善。③足印试验显示cdc2-siRNA组相对步距（75.1%±8.6%）与对照病毒组及非手术组相比明显增加。结论小脑注射携带cdc2-siRNA的rAAV改善了npc-/-小鼠的行为学,有可能为NPC的治疗提供新的有效途径。第三部分携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒对C型尼曼-皮克病小鼠神经病理的影响目的评估小脑注射携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒（rAAV）对C型尼曼-皮克病（NPC）小鼠神经病理的影响。方法①经小脑途径给2周龄npc-/-小鼠注射携带cdc2-siRNA的rAAV。②通过免疫组织化学、HE染色及免疫印迹方法评估注射携带cdc2-siRNA rAAV npc-/-小鼠的病理改变。结果①携带cdc2-siRNA的rAAV在npc-/-小鼠脑中广泛表达。②携带cdc2-siRNA的rAAV明显减少npc-/-小鼠轴突球状体的数量、延缓浦肯野细胞的脱失。③携带cdc2-siRNA的rAAV能有效抑制cdc2、磷酸化的神经丝（由SMI31识别）、磷酸化的有丝分裂相关蛋白（由TG-3和MPM-2识别）及磷酸化的Tau蛋白（由PHF-1识别）的表达。结论小脑注射携带cdc2-siRNA的rAAV对npc-/-小鼠神经元细胞骨架病理具有保护作用,cdc2有可能成为NPC治疗的新靶点。
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标签：小干扰论文; 重组腺相关病毒论文; 基因治疗论文; 神经元变性论文; 型尼曼皮克病论文; 轴突球状体论文; 浦肯野细胞论文; 细胞分裂周期论文;