论文摘要
20世纪后期，大量出现的野生动物和人类内分泌系统异常引起了各国政府及科研机构的高度重视。生殖系统异常是人类内分泌系统异常的主要表现，在人类主要表现为：男性精子密度减小，质量下降，不育比例上升，睾丸癌患者增加；女性乳腺癌、子宫内膜症增加及不良生殖结局增加等。这种现象的产生被认为是环境中存在有干扰内分泌系统的化学物，并提出了环境内分泌干扰物的说法，环境内分泌干扰物（Environmental Endocrine Disruptors，EEDs）既能影响正常的激素产生、释放、运输、代谢或清除，还能影响同源受体结合和/或随后的细胞内受体作用。EEDs的作用机制复杂，抗雄激素活性可能是其机制之一。锰及其化合物是金属元素中用途极为广泛的其中之一，多用于钢铁工业、装饰工程及地下工程的防腐支护，其化合物也是化学制剂、医药、焊接、油漆、合成工业等的重要原料。有报道表明，锰在一定剂量下可致男性性行为障碍，精子异常或减少；女性乳房胀痛、嗜睡、失眠、乏力等，并认为这些早期影响可能与生殖内分泌功能紊乱有关。这些对生殖内分泌系统的损伤作用是否与抗雄激素作用有关，目前还未见确切报道。本研究用大鼠睾丸间质细胞（Leydig）原代培养及Hershberger试验对氯化锰的抗雄激素作用进行综合评价，为进一步研究其生殖和发育毒性作用机制提供理论依据。方法1．体外试验1．1睾丸Leydig细胞的分离、鉴定和纯化取5w龄青春期SD大鼠睾丸，摘取睾丸，分离Leydig细胞，采用台盼蓝活细胞拒染法观察细胞的活率，并于相差显微镜下观察细胞形态。1．2接种不同细胞密度的Leydig细胞睾酮浓度的测定将分离的Leydig细胞以1.0×104个/ml、5.0×104个/ml、1.0×105个/ml、5.0×105个/ml、1.0×106个/ml五个不同浓度接种于24孔板，每个浓度设4个平行样，培养2h后，用睾酮检测试剂盒于放射免疫γ-计数仪上测定各孔培养液中的睾酮含量。1．3不同时间Leydig细胞分泌功能的监测将分离的Leydig细胞以1.0×105个/ml接种于24孔板，分别在1h、12h、24h、48h、72h、96h测定各孔培养液中睾酮的浓度，方法同上，每个时间设4个平行样。1．4 Leydig细胞生长状态的观察将分离的Leydig细胞以1.0×105个/ml接种于4个96孔板，每板接种6孔，分别在培养第1d、2d、3d、4d后，弃上清，每孔加入噻唑蓝（MTT）25μl，放置在培养箱中孵育4h，然后小心吸取干净孔内液体后，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，振荡10min后，用酶联免疫检测仪于490nm波长处测定吸光值。并以光密度值绘制细胞生长曲线。1．5不同浓度HCG刺激下Leydig细胞睾酮分泌的测定将分离的Leydig细胞以1.0×105个/ml接种于24孔板，分别加入0.0IU/ml、0.1 IU/ml、1.0IU/ml、10.0 IU/ml、100.0IU/ml的HCG（human chorionic gonadotropin，人绒毛膜促性腺激素），每个浓度设4个平行样，24h后测定各孔培养液中睾酮的含量，方法同1.2。1．6不同浓度的MnCl2对Leydig细胞存活率的影响用DMEM-F12加双抗的培养基将10.0×10-3mol/L的氯化锰母液配制成浓度1.0×10-6mol/L、2.5×10-6mol/L、5.0×10-6mol/L、1.0×10-5mol/L、2.5×10-5mol/L、5.0×10-5mol/L、1.0×10-4mol/L的氯化锰染毒剂量，将分离的Leydig细胞以1.0×105个/ml接种于24孔板，培养24h后，将培养板中各孔的培养液更换为氯化锰培养基，每个剂量设6个复孔，并设立对照组，继续培养。24h后，每孔吸去900μl培养液，然后加入1％的台盼蓝5μl进行染色，直接在倒置显微镜下观察各孔细胞活细胞比率，每孔计数500个细胞。1．7不同浓度的MnCl2对Leydig细胞睾酮基础分泌的影响将分离的Leydig细胞以1.0×105个/ml接种于24孔板，培养24h后，将培养板中各孔的培养液更换为氯化锰培养基，每个剂量设6个复孔，并设立对照组，继续培养。24h后，监测各孔培养液中睾酮的含量，方法同1.2。1．8不同浓度的MnCl2对HCG刺激的Leydig细胞睾酮分泌的影响将分离的Leydig细胞以1.0×105个/ml接种于24孔板，培养24h后，更换培养基，每孔加入10.0 IU/ml的HCG，然后加入氯化锰并使氯化锰的终浓度分别1.0×10-6mol/L、2.5×10-6mol/L、5.0×10-6mol/L、1.0×10-5mol/L、2.5×10-5mol/L、5.0×10-5mol/L、1.0×10-4mol/L，每个剂量设6个复孔，并设立对照组，继续培养。24h后，监测各孔培养液中睾酮的含量，方法同1．2。2．体内试验2．1 Hershberger试验SD大鼠适应实验环境1w后，腹腔注射2.0％戊巴比妥钠，麻醉完全后行睾丸摘除术去势，7d后分别称重并随机分为6组进行染毒，其中1组为溶剂对照组，皮下注射丙酸睾酮的溶剂玉米油0.2 ml/rat，其余5组大鼠皮下注射丙酸睾酮（testosterone propionate，TP）1.0μg/rat，同时染毒组腹腔注射受试物MnCl2 0.0 mg/kg、7.5 mg/kg、15.0 mg/kg、30.0mg/kg，阳性对照组经口灌胃氟他胺（Flu,100.0mg/kg），体积为0.2ml/100g·bw，每天1次，连续7d。于末次染毒24h后，称重，股动脉采血处死动物，迅速剥离雄激素依赖组织：腹侧前列腺，精囊腺，尿道球腺，肛提肌和球海绵体肌，剔除周围结缔组织和脂肪，吸干表面血渍，于万分之一天平上称量。2．2．去势试验大鼠血清睾酮浓度的测定处死大鼠前经股动脉采血，分离血清，用碘[125I]-人血清睾酮（T）放射免疫分析试剂盒检测血清睾酮含量。测定方法按试剂盒提供的说明书进行。2．3．去势试验大鼠血清前列腺特异抗原浓度的测定处死大鼠前经股动脉采血，分离血清，用碘[125I]-前列腺特异抗原（PSA）免疫放射分析检测血清前列腺特异抗原含量。测定方法按试剂盒提供的说明书进行结果1．体外试验1．1接种不同细胞密度的Leydig细胞睾酮浓度的测定睾丸Leydig细胞在体外培养时，保持了其分泌睾酮的功能，随着接种Leydig细胞密度的增加，培养液中睾酮的含量增加，但细胞密度超过1.0×105个/ml后，培养液中睾酮的浓度增加趋于平缓。1．2不同时间Leydig细胞分泌功能的监测睾丸Leydig细胞在体外培养时，随着时间的增加，其分泌睾酮的能力在24h时达到最高，24h后随着时间的增加，其分泌睾酮的能力下降。1．3 Leydig细胞生长状态的观察睾丸Leydig细胞在体外培养时，随着时间的增加，其细胞的光密度值降低。1．4不同浓度HCG刺激下Leydig细胞睾酮分泌的测定给与HCG刺激后，睾丸Leydig细胞的分泌功能增加，并且随着HCG浓度的能加，Leydig细胞的分泌功能也随之增加，但HCG超过10.0 IU/ml时，Leydig细胞分泌睾酮的能力趋于平缓。1．5不同浓度的MnCl2对Leydig细胞存活率的影响经过24h的染锰培养，5.0×10-6mol/L以上各染锰剂量组睾丸Leydig细胞的存活率均明显低于阴性对照组，而且与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；随着染锰剂量的增加，细胞的存活率降低；并且5.0×10-6mol/L、1.0×10-5mol/L和2.5×10-5mol/L剂量组之间差异均有统计学意义（P＜0.05）。1．6不同浓度的MnCl2对Leydig细胞睾酮基础分泌的影响随着染锰剂量的上升，各染锰组睾丸Leydig细胞分泌睾酮（T）的能力依次下降，并且5.0×10-6mol/L以上各剂量组与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。各染锰剂量组之间相互比较，5.0×10-6mol/L和1.0×10-5mol/L之间比较差异有统计学意义（P＜0.05），而2.5×10-5mol/L、5.0×10-5mol/L和1.0×10-4mol/L相邻两剂量组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。1．7不同浓度的MnCl2对HCG刺激的Leydig细胞睾酮分泌的影响随着染锰剂量的上升，1.0×10-5mol/L以上各染锰组睾丸Leydig细胞对HCG刺激的睾酮分泌能力下降，1.0×10-5mol/L以上各剂量组与阴性对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。2．体内试验2．1 Hershberger试验氟他胺阳性对照组和溶剂对照组的雄激素依赖组织脏器系数均低于阴性对照组（MnCl20.0mg/kg），且差异有统计学意义（P＜0.05）；随着MnCl2染毒剂量的增加，去势雄性大鼠的雄激素依赖组织脏器系数减小，腹侧前列腺和精囊腺脏器系数在MnCl230.0mg/kg剂量时，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。2．2．去势实验大鼠血清睾酮浓度的测定氟他胺阳性对照组血清睾酮浓度降低，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；随着MnCl2染毒剂量的增加，血清睾酮浓度降低，但与阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。2．3．去势实验大鼠血清前列腺特异抗原浓度的测定氟他胺阳性对照组血清前列腺特异抗原浓度降低，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；随着MnCl2染毒剂量的增加，血清PSA浓度降低，但与阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。小结1．在本实验条件下，观察到5.0×10-6mol/L氯化锰可降低原代培养的Leydig细胞的存活率和睾酮的基础分泌能力，1.0×10-5mol/L的氯化锰对HCG诱导的Leydig细胞睾酮分泌能力有抑制作用，并都表现出剂量依赖性，提示氯化锰可抑制Leydig细胞的睾酮分泌。2．30.0 mg/kg氯化锰可降低腹侧前列腺及精囊腺的脏器系数，可能是抑制丙酸睾酮产生的雄激素生理效应，提示这两个器官对MnCl2的雄激素抑制作用比较敏感，也提示了氯化锰可能存在有拮抗雄激素的作用。