不同转移潜能人食管癌细胞系的建立及食管癌转移相关基因的研究

论文摘要

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤,进展快而且预后差。虽然近年来以手术为主的食管癌综合治疗取得了长足的进展,但是侵袭和转移仍然是阻碍进一步提高疗效的最大障碍。因此,对食管癌侵袭转移机制的阐明,将为食管癌的治疗和预后判断提供依据和线索。本研究旨在通过动物实验,筛选具有不同自发性转移能力的食管癌细胞亚群,为食管癌侵袭转移研究建立适宜的细胞模型。并以此为基础,筛选和鉴定食管癌转移相关基因,探讨其作用机制。运用本实验室建立的人食管癌细胞系EC9706,我们通过裸鼠皮下致瘤的自发性转移实验,发现EC9706具有自发性肺转移能力（转移率58%）,经体内接种和体外培养循环交替的方法,获得了MLuB1及MLuC1两个具有不同自发性肺转移潜能的EC9706亚群。其中MLuB1为低转移潜能细胞,转移率22.2%（2/9）;MLuC1为高转移潜能细胞,转移率为87%（7/8）。继续对MLuC1进行了两轮体内筛选,获得了相应的第二代（MLuC2）和第三代细胞（MLuC3）,其中MLuC314细胞来自于淋巴结转移灶。MLuC2细胞导致裸鼠出现衰竭及形成肉眼可见转移灶的时间比MLuC1细胞明显缩短。运用cDNA microarray比较MLuC1与MLuB1的表达谱,发现共有47个基因的表达差异在两倍或两倍以上。与MLuB1相比,19个基因在MLuC1中上调,28个基因下调。运用半定量RT-PCR验证了部分差异表达基因,结果表明它们的表达差异与芯片结果完全一致。这些差异表达基因将为深入探讨食管癌转移的分子机制提供新的研究线索。LAMC2是在MLuC1细胞中上调的基因,编码Ln-5的γ2亚基,文献报道在多种肿瘤组织的侵袭前沿或癌巢边沿的肿瘤细胞常高表达Ln-5γ2,而癌巢内的细胞常常不表达或仅表达微量的Ln-5γ2,而且这种表达方式与患者不良预后呈正相关。生物化学及细胞生物学研究表明,150KDγ2经蛋白水解加工后可产生105KD（γ2′）及80KD（γ2x）两个主要片段,水解后的γ2增强肿瘤细胞的运动能力,水解过程可能促进了肿瘤的侵袭转移。MT1-MMP是参与Ln-5γ2加工的主要蛋白水解酶之一,我们利用MLuB1和MLuC1细胞系作为体外模型,并结合肿瘤组织标本的分析,探讨了食管鳞癌中γ2的水解与MT1-MMP的相关性及其与食管癌侵袭转移的关系。Western-blotting检测表明,MLuB1和MLuC1两个细胞均表达MT1-MMP、γ2′及γ2x,并且γ2水解片段及MT1-MMP的表达量与细胞转移潜能呈正相关。进一步检测了121例食管癌组织中Ln-γ72和MT1-MMP的表达,发现γ2表达阳性率为61.9%（75/121）,其表达与肿瘤的浸润程度显著正相关（P=0.035）。MT1-MMP表达阳性率为71.9%（87/121）%,其表达与肿瘤浸润深度及临床分级显著正相关（P=0.021及0.045）。尤为重要的是,在75例γ2表达阳性及87例MT1-MMP表达阳性的病例中,有60例共表达γ2与MT1-MMP,两个蛋白的共表达与肿瘤的浸润程度具有更显著的正相关关系（P=0.012）,表现为发生深度浸润的患者共表达率高。结合细胞系的实验结果,我们认为γ2和MT1-MMP与食管癌的侵袭转移关系密切,并且二者可能存在相互作用。Western-blotting分析的结果支持了这种可能性,我们发现同一患者肿瘤组织中γ2的水解片段明显多于癌旁正常组织。同时,MT1-MMP的活化形式仅存在于肿瘤组织中。为了进一步验证我们的推测,运用RNAi技术抑制MLuC1细胞中MT1-MMP蛋白表达,结果显示γ2的水解片段明显减少,同时细胞的体外运动能力降低。以上结果提示,MT1-MMP很可能是食管癌中参与Ln-5γ2水解的重要蛋白水解酶之一,两者的相互作用共同促进了食管癌的侵袭转移。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 人食管癌自发性转移模型体系的建立及食管癌转移相关基因的筛选
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 Ln-5在人食管鳞癌侵袭转移中作用机制的探讨
• 前言
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 文献综述Ⅰ Ln-5γ2链与肿瘤的侵袭转移
• 文献综述Ⅱ Survivin基因与肿瘤
• 参考文献
• 致谢