论文摘要
目的:1.观察不同细胞模型中miR-1对HBV复制和基因表达的影响。2.阐述miR-1直接和间接调节HBV复制的可能作用机制,筛选以及验证miR-1的靶基因,了解miR-1对肝癌细胞增殖和分化的影响。3.探讨组蛋白去乙酰化酶（HDAC）基因家族在microRNA调节HBV复制中的可能作用。方法:1.利用体外合成的miR-1分子转染HepG2.215和HepG2.117 HBV稳定转染细胞系,以及与具有复制能力的HBV感染性克隆pSM2,pHY106共转染Huh7和HepG2细胞,Southern blot检测细胞内HBV的复制中间体,Realtime PCR检测细胞内HBV转录产物以及细胞上清中HBV颗粒,CMIA检测HBsAg与HBeAg抗原的表达,Westernblot检测HBcAg抗原的表达。2.针对miRNA合成酶Dicer的siRNA（siDicer）、miR-1种子序列突变体（mut-miR-1）、miR-206转染HepG2.215细胞,Southern blot检测细胞内HBV的复制中间体,CMIA法检测HBsAg与HBeAg抗原的表达。miR-1特异抑制剂（2’-OMe-anti-miR1）和沉默复合体的siRNA（siRCK/p54、siGW182、siAgo-2、si-FxR1）与miR-1共转染HepG2.215细胞,Southern blot检测细胞内HBV的复制中间体,CMIA法检测HBsAg与HBeAg抗原的表达。3.利用生物信息学软件和荧光素酶报告基因系统,查找miR-1可能的结合位点。构建含有HBV基因组序列、SP1,SP2,C,X启动子序列、E2F5基因3’非编码区（3’UTR）的报告质粒,与miR-1共转HepG2,Huh7细胞,检测荧光素酶活性。Western blot检测细胞内E2F5蛋白的表达。4.WST-1细胞增殖实验,H3胸腺嘧啶掺入实验,流式细胞仪PⅠ染色法,检测miR-1对HepG2.215细胞增殖能力与细胞周期的影响。5.针对HDAC基因家族的siRNA（siHDAC1、siHDAC2、siHDAC3、siHDAC4）转染HepG2.215细胞,Southern blot检测细胞内HBV的复制中间体,CMIA检测HBsAg与HBeAg抗原的表达。Western blot检测miR-1转染后HDAC4蛋白的表达,RealtimeRT-PCR方法检测细胞分化相关基因PCK2的表达。结果:1.利用siRNA阻断胞内miRNA的合成途径可以降低HBV的复制。增强HepG2215细胞内miR-1的表达可以明显上调HBV的复制,且具时间与剂量依赖性。与对照相比,HBV的转录产物以及病毒蛋白（HBsAg、HBeAg、HBcAg）的表达产物也增加,上清中分泌的病毒颗粒也明显增加。在其他细胞模型,比如HepG2.117细胞和HBV复制性克隆瞬时转染的HepG2和Huh7细胞中,也可观察到类似效应。2.种子序列突变的mut-miR-1与具有相同种子序列的miR-206对HepG2.215细胞中的HBV复制没有影响。miR-1抑制剂2-OMe-miR1可完全阻断miR-1对HBV复制的上调效应。针对沉默复合体的siRNA能降低HBV复制,同时也能部分阻断miR-1上调HBV复制的效应。3.利用pGL3报告质粒系统,miR-1能增强HBV启动子的转录活性,尤其是S基因启动子。miR-1也可上调包含有HBV基因组全长序列,以及部分序列（1830-2849）的pmiR-report报告质粒的基因表达。但是,利用现有的miRNA靶基因预测软件未能在HBV序列上找到可能的结合位点。4.miR-1转染HepG2.215细胞后,细胞增殖和DNA复制实验提示miR-1可以抑制细胞生长速度,使细胞分裂减缓;细胞周期分析发现G1期细胞数目增多,且可导致明显的G1/S阻滞;Western blot显示E2F5和HDAC4的蛋白表达降低。5.siHDAC3和siHDAC4转染后可上调HBV复制及其基因表达。siHDAC1、siHDAC2无明显效果。HDAC的化学抑制剂TSA亦可上调HBV复制,降低HDAC4的蛋白表达。Realtime RT-PCR发现细胞分化相关基因Albumin、PCK2的表达增加。结论:1.miR-1可通过转录和转录后水平的调节作用,显著促进HBV复制和基因表达,增加病毒分泌。2.miR-1上调HBV复制具有序列特异性,沉默复合体的形成参与了这个过程。3.miR-1可能通过靶基因E2F5和HDAC4阻滞细胞周期,抑制细胞增殖与分裂,促进肝癌细胞分化,从而改变肿瘤细胞的恶性表型。4.miR-1上调HBV复制很可能是其调控多类病毒复制相关基因的表达从而产生的协同效应。本研究的创新点及意义:1.在国际上首次发现细胞中存在能影响HBV复制的细胞miRNA分子。miR-1可通过序列特异性作用,控制肝细胞内特定基因的表达,进而调节HBV的复制和基因表达,为进一步研究HBV在肝细胞中复制的生物学机制奠定基础,也为miRNA的生物学功能研究提供了一个参考。2.通过序列分析和报告基因技术,初步阐述了miR-1调节HBV复制的可能的分子作用机制,为进一步阐明HBV感染的分子机制和发现新的抗HBV靶向分子治疗方案提供新的思路。3.研究发现miR-1的靶基因多为参与细胞生长和凋亡的重要基因,同时观察到miRNA分子可以抑制肝癌细胞增殖,促进细胞分化,提示miRNA具有重要的抑癌基因作用,可为miRNA应用于肝癌基因治疗提供参考。
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标签：肝细胞论文; 乙型肝炎病毒论文; 组蛋白去乙酰化酶论文; 肝细胞癌论文;