论文摘要
本论文围绕实时PCR基因分型中的引物基因分型和探针基因分型两个关键技术展开了研究,研究工作主要包括ARMS引物、硫代磷酸化修饰引物以及荧光双链置换探针用于实时PCR基因分型的研究。第一章,以酒精代谢过程中的关键酶—乙醇脱氢酶2的基因多态性为研究对象,采用新型的荧光染料EvaGreen为实时PCR指示剂,建立了ARMS改良四步法的实时PCR分型体系。通过对传统三步PCR循环进行改良,即根据目的产物和引物二聚体的熔点差异,在传统延伸步骤之后增加一步恒温79°C检测荧光步骤,可消除引物二聚体的影响。应用建立的实时PCR体系检测150份人外周血DNA标本,经电泳验证,该方法可以准确的对乙醇脱氢酶2基因进行分型。第二章,以β-地中海贫血症中国地区5个常见突变位点为研究对象,建立了硫代磷酸化修饰引物结合高保真DNA聚合酶的实时PCR基因分型技术。首先考察了普通的ARMS引物应用EvaGreen荧光染料的实时PCR基因分型情况,接着系统考察了硫代磷酸化修饰引物3′端不同位置的碱基后,引物对核酸外切酶的耐受作用。结果表明,引物3′最末端一个碱基硫代磷酸化修饰引物的S型异构体能够完全抑制核酸外切酶的酶切作用,结合高保真的DNA聚合酶用于基因分型,可以得到特异的分型结果。应用建立的实时PCR基因分型体系检测了106份临床基因组DNA标本,检测结果准确率100%。第三章,以亚洲人群中具有高度遗传多态性的乙醛脱氢酶2基因为研究对象,建立了荧光双链置换探针对单个SNP位点的实时PCR基因分型体系。针对乙醛脱氢酶2的两种基因型,设计了标记FAM的野生型探针和标记ROX的突变型探针,构建单管实时PCR分型体系。灵敏度实验表明该方法可以检测出低至1个拷贝的基因组DNA模板。应用建立的检测体系对136份人外周血DNA标本进行基因分型,与经典的RFLP方法相比,该体系简便快速,更适用于大规模的人群筛查和临床标本的检测。第四章,以具有高度多态性的HLA基因的A座位为研究对象,建立了荧光双链置换探针对多个SNPs位点的实时PCR基因分型体系。针对HLA-A基因多态性位点集中的区域,分别设计对应外显子2和外显子3的扩增引物、阳性对照探针和18条等位特异分型探针。对探针标记不同荧光基团,构建6管四色检测体系,通过综合分析6个反应管中的探针信号,来判断标本的基因型。本论文通过对等位特异引物分型技术和双链置换探针分型技术的细致考察,建立了可广泛应用于人类基因组DNA基因分型和突变检测的实时PCR体系。实时PCR技术操作简便,检测快速,有望成为一项适合于临床应用的筛查技术。