鸡传染性支气管炎病毒基因型与血清型相关性初步研究

论文摘要

鸡传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病,给养禽业造成巨大的经济损失。由于IBV基因组RNA复制的不连续性以及RNA聚合酶的不完全校对机制,基因组十分容易发生点突变、缺失、插入和不同毒株基因组间的同源重组等,使得病毒的基因型、血清型、结构蛋白、免疫原性等容易发生变化,造成病毒临床表现复杂,各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用,从而给本病的防治带来很大的困难。IBV毒株的分型对于实施有效的疫病控制、流行病学调查及研究病毒的演化意义重大。本研究采用基因分型与血清学分型相结合的方法对国内近年来所流行的毒株和疫苗株、检验用毒株进行分型,进而判定两者之间的相关性,更真实地反映其生物学特征,为目前鸡传染性支气管炎病毒的分型提供一定的参考,有助于IB疫苗的正确使用,对今后鸡传染性支气管炎的防治也有着积极的意义。本研究以收集自国内不同地区的17株IBV分离株、2株疫苗生产用毒株（M41、W93）和1株攻毒用强毒株X株为研究对象,采用自行设计特异性引物经RT-PCR技术扩增得到20株IBV的S1蛋白基因片段。将目的基因S1插入到pGEM-T Easy载体,重组质粒经PCR鉴定为阳性后,对插入片段进行测序。应用DNAStar分析软件的Clustal V方法将克隆测序的S1蛋白基因分别与GenBank中的20株国内外参考毒株的S1基因进行序列比较和同源性分析,绘制S1基因系统进化树。结果表明:20株IBV毒株与我国IBV分离株、我国常用疫苗株以及国外参考毒株分为3个基因型。其中,第一个基因型为LX4型,包含了本研究中从我国不同地区收集的14株IBV毒株（BJ-0,BJ-2,BJ-3,BJ-4,BJ-5,333-4,333-5,333-6,333-7,333-8,333-9,333-10,DC07-1,DC07-2）,其中BJ-0、BJ-2、BJ-3、BJ-4、BJ-5这5株的亲缘关系均高于99.8%,333-4,333-5,333-6,333-7,333-8,333-9,333-10,DC07-2的亲缘关系均高于99.3%,DC07-1与它们的亲缘关系较远,介于87.387.8%;第二个基因型为Mass型,包括本研究中的5株分离株333-1,333-2,333-3,M41,W93,我国常用IB疫苗株H52、H120和国外IBV分离株（西班牙、美国、韩国、日本等）。其中333-1,333-2,333-3这3株之间的亲缘关系均高于99.5%,W93与IBN株亲缘关系较近,M41与Spain-98-308的亲缘关系较近;第三个基因型为X型,本研究中的X株属于该型,且X株与Ark99的亲缘关系很近,同源性达97.8%。根据20株IBV毒株基因分型的结果,从S1基因的系统进化树中的三个基因群中分别选取差异性较大的6株IBV毒株,即X型的X株,Mass型中的M41、W93、333-3,LX4型中的DC07-1、333-7株,进行血清学分型试验。首先对其进行纯净性检验,测定每株IBV的鸡胚半数感染量（EID50）,并免疫3周龄SPF鸡制备高免血清,进行血清交叉中和试验,计算IBV各毒株间的抗原性的相关系数（R）。结果表明,6株IBV毒株是纯净的,不含其它微生物,各毒株的EID50均高于106.0EID50/0.1mL。经免疫学方法计算,X型X株与Mass型的M41、W93、333-3的抗原性相关系数分别为:7%、14%、8%（<25%）,与LX4型的DC07-1、333-7的抗原性相关系数分别为6%、9%（<25%）,说明X型的X株与Mass型的M41、W93、333-3,与LX4型的DC07-1、333-7分别属于不同的血清型,X株与它们之间的抗原交叉较低;Mass型的333-3与同型的M41、W93的抗原性相关系数分别为97%、98%（>80%）,与LX4型的DC07-1、333-7的抗原性相关系数分别为8%、13%（<25%）,说明Mass型的333-3与同型的M41、W93属于同一个血清型,它们之间的抗原交叉较高,而与LX4型的DC07-1、333-7属于不同的血清型,它们之间的抗原交叉较低;Mass型的M41与同型的W93的抗原性相关系数为35%（>25%）,与LX4型的DC07-1、333-7的抗原性相关系数为7%、18%（<25%）,说明Mass型的M41与同型的W93属于同一血清型,两者之间的抗原交叉较高,而与LX4型的DC07-1、333-7的抗原交叉较低,属于不同的血清型;Mass型的W93与LX4型的DC07-1、333-7的抗原性相关系数分别为13%、18%（<25%）,说明它们属于不同的血清型,它们之间的抗原交叉较低;LX4型的DC07-1与同型的333-7的抗原性相关系数为44%（>25%）,两者之间的抗原交叉较高,属于同一血清型。综上可知:X型的X株与Mass型中M41、W93、333-3以及LX4型中的DC07-1、333-7分别属于不同的血清型,而Mass型中M41、W93、333-3属于相同的血清型,LX4型中的DC07-1、333-7属于相同的血清型。因此,6株IBV毒株经血清交叉中和试验可分为三个血清型:333-3,M41,W93为同一血清型,DC07-1,333-7为同一血清型,X株为另外一个血清型。综上,本试验对20株IBV毒株进行了基因分型,根据S1基因的系统进化树选择其中差异性较大的6株进行血清交叉中和试验,结果表明鸡传染性支气管炎病毒的基因分型与血清分型相一致,初步证明了IBV的基因型与血清型存在一致性。这为目前鸡传染性支气管炎病毒的分型提供一定的参考,对今后鸡传染性支气管炎的防治也有着积极的意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语中英文对照表
• 第一章 引言
• 1 国内外研究现状
• 1.1 鸡传染性支气管炎病毒病原学特点
• 1.2 IBV的鉴定分型方法
• 1.3 鸡传染性支气管炎的免疫机理
• 1.4 综合防控措施
• 2 研究目的和意义
• 第二章 鸡传染性支气管炎病毒基因分型研究
• 1 试验材料
• 1.1 毒株
• 1.2 鸡胚
• 1.3 主要试剂及其配制方法
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 试验用材料
• 2 试验方法
• 2.1 病毒的繁殖
• 2.2 引物设计：
• 2.3 病毒RNA的提取
• 2.4 病毒N、S1基因的扩增
• 2.5 PCR产物鉴定及纯化回收
• 2.6 PCR纯化产物的连接和转化
• 2.7 S1基因序列的测定、比对、构建系统进化树
• 2.8 S1基因序列的分析、比较
• 3 试验结果
• 3.1 IBV致鸡胚病变特征
• 3.2 IBV尿囊液对鸡红细胞的凝集活性
• 3.3 IBV N、S1基因引物设计
• 3.4 病毒N、S1基因的扩增结果
• 3.5 IBV S1基因序列、S1蛋白氨基酸序列比较及生物进化分析
• 4 讨论与小结
• 4.1 IBV毒株特异性鉴定
• 4.2 IBV毒株S1基因序列的分析
• 4.3 20株IBV毒株遗传衍化关系
• 第三章 鸡传染性支气管炎病毒血清学分型研究
• 1 试验材料
• 1.1 毒株
• 1.2 鸡胚
• 1.3 仪器
• 1.4 试验用材料
• 2 试验方法
• 2.1 毒株的选择
• 2.2 纯净性检验：进行细菌、霉菌、支原体及外源病毒检验
• 2.3 鸡传染性支气管炎病毒EID50测定
• 2.4 免疫
• 2.5 采血
• 2.6 血清灭活处理
• 2.7 交叉中和反应
• 2.8 结果判定
• 2.9 IBV毒株间抗原的交叉相关性
• 3 结果
• 3.1 毒株的选择
• 3.2 鸡传染性支气管炎病毒的纯净性检验
• 3.3 IBV EID50测定结果
• 3.4 免疫
• 3.5 采血
• 3.6 血清的灭活处理
• 3.7 血清交叉中和试验
• 3.8 IBV毒株高免血清的中和效价
• 3.9 IBV毒株间抗原的交叉相关性
• 4 讨论与小结
• 4.1 IBV毒株间的血清交叉中和试验
• 4.2 IBV的血清型与IB疫苗的使用
• 第四章 结论
• 1 主要结论
• 2 创新点
• 3 有待进一步解决的问题
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历