建立基于人PPARs为靶标的药物筛选细胞平台

论文摘要

目的：过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）可介导多种物质代谢途径和药物治疗效应。本研究旨在通过PPARs基因载体质粒与过氧化物酶体增殖物反应元件（PPRE）报告质粒共转染293T细胞,人工模拟PPARs信号通路,通过阳性药物干预实验,评价该细胞模型作为药物筛选新平台应用的可行性,为进一步筛选具有生物活性的PPARs配体激动剂提供一种新的细胞模型筛选方法。方法：（1）细胞培养及质粒共转染：用含10%胎牛血清的HG-DMEM于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养293T细胞。取第3代细胞,按8×104个细胞/孔的细胞密度接种于24孔板中,待细胞生长汇合度达90～95%时,采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000进行质粒共转染。实验分为phPPARa-IRES2-EGFP转染组、phPPARy-IRES2-EGFP转染组和空载体pIRES2-EGFP转染组（对照组）,每组均共转染含人PPRE报告质粒ptk-PPRE×3-luc（含萤火虫荧光素酶报告基因）、内部对照质粒pRL-CMV（含海肾荧光素酶报告基因）。（2）转染效率检测：转染36 h后,采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）表达情况,并用流式细胞术（FCM）检钡phPPARa-IRES2-EGFP和phPPARy-IRES2-EGFP质粒的转染效率。（3）特异性PPARs配体阳性药物干预293T细胞转染体系：转染14 h后,各转染组分别力入1‰DMSO、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6 mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L浓度梯度的阳性药物（phPPARa-IRES2-EGFP转染组选用WY14643, phPPARy-IRES2-EGFP转染组选用罗格列酮）,药物作用24 h后采用双荧光素酶报告基因检测法（DLR）检测双荧光素酶活性,获得不同药物浓度作用下的双荧光素酶报告基因比值（F/R值）,分析阳性药物作用的量-效关系；并用10-5 mol/L浓度阳性药物干预实验进行时-效分析。（4）PPARs药物筛选细胞平台特异性鉴定：对上述反应体系交叉更换干预药物,PPARa反应体系采用罗格列酮,而PPARy则用WY14643,用以检测上述体系的特异性。实验还采用RXRa配体全反式维甲酸（ATRA）代替PPARs日性药物,分别对上述反应体系进行干预,以了解上述体系是否可通过全反式维甲酸激动。（5）荧光定量PCR检测阳性药物作用后各转染组细胞PPARs及RXRa基因mRNA表达水平。（6）PPARs药物筛选细胞平台应用能力评价：采用临床使用的贝特类降脂药苯扎贝特、环丙贝特、氯贝丁酯对建立的PPARa药物筛选细胞平台进行应用检测。结果：（1）荧光显微镜下phPPARa-IRES2-EGFP和phPPARy-IRES2-EGFP转染293T细胞呈现绿色荧光；FCM分析结果显示,2种质粒转染组转染效率分别达为68.30%和67.56%,荧光显微镜观察GFP报告基因表达强。（2）阳性药物干预相应293T细胞转染体系的F/R值均具有良好的量-效和时-效关系,DLR检测量-效分析结果：2种人PPARs基因细胞转染体系的PPRE报告质粒荧光素酶报告基因表达水平（F/R值）随着相应阳性药物浓度升高而升高,但药物浓度过高又会抑制其表达F/R值反而降低（P<0.01）,而空载体pIRES2-EGFP转染组在不同药物及浓度作用下的F/R值始终呈低值基线状态；时-效分析结果：2种人PPARs基因细胞转染体系的PPRE报告质粒荧光素酶报告基因表达水平（F/R值）随着相应阳性药物作用时间的延长而升高（P<0.01）. （3）PPARa特异性配体WY14643不能激动PPARy转染的293T细胞反应体系,而罗格列酮则可部分激动PPARa转染的293T细胞反应体系,但其反应强度不及WY14643（P<0.05）。2种PPAR转染细胞体系均不能被全反式维甲酸有效激活。（4）RT-PCR检测结果显示,不同阳性药物及浓度作用下的phPPARa-IRES2-EGFP转染组293T细胞PPARa mRNA表达水平比空载体对照组高4个数量级,phPPARy-IRES2-EGFP转染组293T细胞PPARy mRNA表达水平比空载体对照组高2～3个数量级,mRNA表达水平提示导入的重组质粒能够高效表达PPARs。而各组RXRamRNA呈一致性的低水平表达。（5）贝特类降脂药苯扎贝特、环丙贝特、氯贝丁酯对建立的PPARa药物筛选细胞平台均呈现良好的量-效反应性,但反应强度因3种药物浓度不同而存在差异（P<0.05）。结论：成功构建了一种新的基于以人PPARs受体为靶标的药物筛选细胞平台,为进一步研究PPARs功能和筛选PPARs配体激动药物提供了一种模拟信号通路的生物活性反应模型体系。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1 材料
• 1.1 质粒和细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要实验仪器及耗材
• 1.4 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 质粒扩增与抽提
• 2.2 293T细胞的培养
• 2.3 质粒共转染293T细胞
• 2.4 药物干预
• 2.5 双荧光素酶报告基因检测法检测双荧光素酶活性
• 2.6 荧光定量PCR检测不同浓度阳性药物干预的转染细胞hPPARα、hPPARγ及RXRα mRNA表达
• 2.7 PPARα药物筛选细胞模型的应用
• 2.8 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 转染PPARs基因质粒293T胞GFP表达情况及转染效率分析
• 3.2 转染PPARs基因质粒293T细胞药物干预后的荧光素酶报告基因表达检测
• 3.3 药物干预状态下转染的293T细胞hPPARs、RXRα mRNA的表达
• 3.4 PPARα药物筛选细胞平台的应用测试结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介