用RNA干扰方法探讨原癌基因c-erbB2在原始卵泡生长启动中的作用

论文摘要

目的:用RNA干扰方法,在引发原癌基因c-erbB2表达沉默或抑制的情况下,观察其在原始卵泡的生长启动中的作用及其在介导原始卵泡启动生长的重要因子——表皮生长因子（EGF）在此过程中的作用。方法:原始卵泡的获取与培养;针对原癌基因c-erbB2进行RNA小干扰片段（small interference RNA ,siRNA）的构建并用脂质体介导转染原始卵泡;用RT-PCR法检测原癌基因c-erbB2mRNA的表达;用wester blotting检测其蛋白表达情况;通过Knock-Down of基因c-erbB2的表达后,观察原始卵泡的启动情况。结果:1.大鼠卵巢中有原癌基因c-erbB2mRNA表达,检测RT-PCR扩增产物序列（322bp）,并与GeneBank中的序列比较,结果一致。2.卵巢转染siRNA后,用RT-PCR,western blot检测靶基因c-erbB2表达,发现c-erbB2mRNA水平明显下调（P<0.05）。三对siRNA抑制率分别为49.6%、46.7%、82.6%。同时其蛋白表达也明显下调（P<0.01）。3.选择最佳抑制效果的那对siRNA,转染培养中的卵巢,观察到:对照组8天后大部分原始卵泡发育为初级卵泡,而siRNA组初级卵泡和次级卵泡数明显减少（P<0.01）;EGF组与对照组相比,原始卵泡数减少,次级卵泡数明显增多（P<0.01）; EGF+siRNA组与对照组比较,无明显差别（P>0.05）。结论:1.大鼠卵巢中有原癌基因c-erbB2 mRNA表达2.siRNA可以特异性地抑制目的基因的表达3.通过抑制原癌基因c-erbB2的表达,原始卵泡的启动、生长受到抑制。EGF可以促进原始卵泡的启动生长,对早期卵泡的生长有促进作用,siRNA通过抑制c-erbB2的表达,可以阻断其促进效应。以上结果提示,c-erbB2参与原始卵泡启动生长过程的调控,并介导EGF促进原始卵泡的启动生长。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写一览表
• 第一章 前言
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 原始卵泡的获取与培养
• 2 mRNA 的表达'>2.2.2 利用 RT-PCR 技术检测卵巢中c-erbB₂ mRNA 的表达
• 2.2.3 RNA 干扰片段的构建、转染、及筛选
• 2.2.4 免疫蛋白印迹（westernblot）
• 2.2.5 形态学分析
• 2.2.6 统计分析
• 第三章 结果
• 3.1 体外培养卵巢过程其形态学变化
• 3.2 逆转录后的cDNA 的序列检测
• 3.2.1 样本的测序结果
• 3.2.2 比对结果
• 3.3 转染siRNA 后，靶基因的表达情况检测
• 3.3.1 RT-PCR 结果
• 3.3.2 Western blot 结果
• 3.4 转染siRNA 后，各实验组其培养的卵巢形态学变化
• 第四章 讨论
• 4.1 原始卵泡的获取以及大鼠卵巢器官的体外培养
• 2在卵巢中的表达'>4.2 原癌基因c-erbB₂在卵巢中的表达
• 2在原始卵泡启动中的作用'>4.3 原癌基因c-erbB₂在原始卵泡启动中的作用
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间的研究成果