牛膝多肽神经保护作用的实验研究

论文摘要

目的:观察牛膝多肽（A. bidentata polypeptides, ABPP）的神经保护作用及其相关作用机制。方法:（1）采用大脑中动脉线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,通过测定神经功能缺陷评分、脑梗死百分比（TTC法）,在体观察牛膝多肽的神经保护作用。（2）以体外原代培养胎鼠海马神经元为研究对象,建立N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）损伤模型。通过MTT检测,离体观察牛膝多肽的神经保护作用。（3）Hoechst33258/PI双染色、PI流式细胞仪检测、LDH检测、DNA ladder检测等观察牛膝多肽对NMDA诱导的海马神经元调亡的影响。（4）利用钙离子荧光探针Fluo-3/AM标记海马神经元,通过激光共聚焦显微镜检测,观察牛膝多肽对NMDA引起的海马神经元胞内钙离子浓度的影响。（5）通过Western blot,观察牛膝多肽对NMDA引起的海马神经元Bax蛋白过表达的影响。（6）通过Caspase-3活性检测,观察牛膝多肽对NMDA引起的海马神经元Caspase-3蛋白活性增高的影响。（7）采用亲脂性阳离子荧光染料Rhodamine123、分子探针DCFH-DA标记海马神经元,通过多功能酶标仪检测NMDA引起的海马神经元线粒体跨膜电位、活性氧自由基含量的变化。同时观察牛膝多肽对NMDA引起的海马神经元线粒体跨膜电位、活性氧自由基含量的影响。（8）采用全细胞膜片钳技术,观察牛膝多肽对NMDA电流峰值、平台期电流值、失敏系数的影响。（9）采用了含NR2A、NR2B两种不同亚单位类型NMDA受体的选择性抑制剂:Ro-256981、NVP-AAM007,及两种不同培养时间的海马神经元:体外培养8天、13-14天,通过MTT检测,观察两种不同的选择性抑制剂对NMDA诱导神经元损伤的影响,同时观察牛膝多肽对NMDA诱导神经元损伤的影响。（10）应用钙离子荧光探针Fluo-3/AM标记通过激光共聚焦显微镜检测,观察含NR2A、NR2B两种不同亚单位类型NMDA受体的选择性抑制剂:Ro-256981、NVP-AAM007,对NMDA和Bicuculline引起的海马神经元胞内钙离子浓度的影响,并观察牛膝多肽对含NR2A、NR2B两种不同亚单位类型NMDA受体介导的胞内钙离子浓度的影响。（11）采用全细胞膜片钳技术,观察含NR2A、NR2B两种不同亚单位类型NMDA受体的选择性抑制剂:Ro-256981、NVP-AAM007,对NMDA电流峰值、平台期电流值、失敏系数的影响,并观察牛膝多肽对含NR2A、NR2B两种不同亚单位类型NMDA受体介导的NMDA电流峰值、平台期电流值、失敏系数的影响。结果:（1）局灶性脑缺血再灌注损伤能引起大鼠死亡,死亡率达到50%,对存活的大鼠,其神经功能缺陷评分明显增高（p<0.01）和脑梗死百分比增加（p<0.01）,尾静脉给予牛膝多肽（0.2mg/kg）治疗,可以降低神经功能缺陷评分,降低脑梗死百分比（p<0.01）。（2）通过MTT检测结果显示,NMDA能降低培养的海马神经元的活力,而且随着NMDA浓度的增加、作用时间的延长,神经元的活力逐渐下降。牛膝多肽能抑制NMDA引起的海马神经元活力下降,并与其剂量相关。（3）Hoechst33258/PI双染色、PI流式细胞仪检测、LDH检测、DNA ladder检测结果显示,NMDA能诱导海马神经元调亡,牛膝多肽（1μg/ml）能拮抗NMDA诱导的海马神经元调亡。（4）钙实时成像结果显示,NMDA能引起海马神经元胞内钙荧光强度增加,并随着NMDA浓度增加,荧光强度增强。AP-V、MK801能抑制胞内钙荧光强度增高。预先、同时、后加入牛膝多肽都能减弱NMDA引起海马神经元胞内钙荧光强度增加,并随着浓度增高,抑制程度增加。（5）通过MTT检测结果显示,Bax通道阻断剂能拮抗NMDA引起的海马神经元活力的降低。RT-PCR和Western blot结果提示,海马神经元Bax mRNA及其蛋白表达随着NMDA作用时间的变化而变化,其中作用30min Bax蛋白表达明显增加（p<0.05）。牛膝多肽能拮抗NMDA损伤引起的海马神经元Bax蛋白表达增高。（6）多功能酶标仪实时测定结果显示,分子探针DCFH-DA氧化后形成的荧光产物DCF的荧光强度,随着NMDA浓度的增加而逐渐增高,而牛膝多肽能抑制NMDA引起的荧光强度增强,并随着其浓度的增加,其抑制程度逐渐增强。（7）多功能酶标仪实时测定线粒体跨膜电位,结果显示NMDA能引起线粒体跨膜电位明显下降,而牛膝多肽能拮抗线粒体跨膜电位的下降。（8）Caspase-3活性检测结果显示,NMDA能引起海马神经元Caspase-3蛋白活性增强,牛膝多肽能拮抗NMDA引起海马神经元Caspase-3活性增强（p<0.05）。（9）通过MTT检测结果显示,体外培养8天、13-14天的海马神经元,NMDA都能引起细胞活力急性下降,Ro-256981、NVP-AAM007能拮抗NMDA引起的细胞活力下降（p<0.05）,然而牛膝多肽不能抑制NMDA引起的急性细胞活力下降。体外培养8天、13-14天的海马神经元,Ro-256981能拮抗NMDA引起的迟发性细胞活力下降（p<0.05）。体外培养8天的海马神经元,NVP-AAM007能拮抗NMDA引起的迟发性细胞活力下降（p<0.05）,牛膝多肽（0.1μg/ml）能拮抗NMDA引起的迟发性细胞活力下降（p<0.01）,而牛膝多肽（10μg/ml）不能拮抗NMDA引起的细胞活力迟发性下降,但NVP-AAM007能恢复牛膝多肽拮抗NMDA引起的迟发性细胞活力下降作用。体外培养13-14天的海马神经元,NVP-AAM007能加剧NMDA引起的细胞活力迟发性下降（p<0.01）。牛膝多肽（10μg/ml）能明显抑制NMDA引起的迟发性细胞活力下降（p<0.01）。（10）钙实时成像结果显示,NVP-AAM007、Ro-256981能部分抑制NMDA引起的海马神经元胞内钙荧光强度增加。当NVP-AAM007存在的时候,牛膝多肽能抑制NMDA引起的海马神经元胞内钙荧光强度增加。当Ro-256981存在的时候,牛膝多肽能增强NMDA引起的海马神经元胞内钙荧光强度增加。NVP-AAM007、Ro-256 981能部分抑制Bicuculline引起的海马神经元胞内钙荧光强度增加。当NVP-AAM007存在的时候,牛膝多肽能抑制Bicuculline引起的海马神经元胞内钙荧光强度增加。当Ro-256981存在的时候,牛膝多肽能增强Bicuculline引起的海马神经元胞内钙荧光强度增加。（11）全细胞模式记录NMDA电流,结果显示:体外培养8天的海马神经元,牛膝多肽能降低NMDA平台期电流值,增加其失敏系数;培养13-14天的海马神经元,牛膝多肽能使NMDA电流峰值、平台期电流值增高,但降低其失敏系数。Ro-256981、NVP-AAM007能降低NMDA电流峰值、平台期电流值。当NVP-AAM007存在的时候,牛膝多肽能减低NMDA电流峰值、平台期电流值、失敏系数;当Ro-256981存在的时候,牛膝多肽能增强NMDA电流峰值、平台期电流值,降低其失敏系数。结论:（1）牛膝多肽在离体和在体具有神经保护作用。（2）牛膝多肽通过抗神经元调亡实现神经保护作用。（3）牛膝多肽对NMDA受体过度激活引起的钙超载、ROS形成、Bax过表达、Caspase-3激活具有抑制作用。（4）牛膝多肽对含NR2A、NR2B亚单位的NMDA受体具有不同的调节作用,对含NR2A亚单位的NMDA受体具有增强作用,而对NR2B亚单位NMDA受体具有抑制作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 研究背景
• 正文
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 实验结果
• 2.1 牛膝多肽神经保护作用研究
• 2.2 牛膝多肽神经保护作用的机制
• 2.3 牛膝多肽对NMDA 受体不同亚型的影响
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 小结与有待解决的问题
• 学习期间发表、待发表论文及学术交流
• 本研究的基金资助
• 综述
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢