论文摘要
临床上化学药物抗病毒治疗的基础是抑制嗜肝DNA病毒复制,抑制复制可减少模板cccDNA的形成,同时抑制感染细胞中靶抗原的表达,以缓解炎症应答。清除肝细胞核内cccDNA是对慢性乙肝抗病毒治疗取得持续疗效的关键。目前联合用药包括联合应用抗病毒化合物、免疫调节、治疗用疫苗,以及基因靶向疗法。中药复方治疗肝炎在临床上应用广泛,研究表明中药复方在抗病毒复制、调节免疫功能、减轻肝细胞损伤、改善肝功能,尤其是抗肝纤维化、防治早期肝硬变多环节都能起到作用,综合疗效优于单纯的西药。茵栀苦复方是在茵陈蒿汤基础上化裁而得,由茵陈、栀子和苦参的三味中药按比例混合而成。本研究借助2.2.15细胞模型和鸭乙肝动物模型,对茵栀苦复方抗肝炎复方药效进行了系统评价,并对复方抗肝炎的机理做了初步探讨,以拉米呋啶为阳性对照,进行药物的细胞毒性试验及对HBsAg、HBeAg抑制试验,建立了用SyBr greenⅠ荧光实时定量PCR方法细胞HBV DNA的方法,运用鸭乙肝模型观察了中药复方在体内对DHBV-DNA复制的抑制作用,为正确评价药效建立了简便价廉的操作方法。本研究中观察了茵栀苦复方对2.2.15细胞上清HBsAg和HBeAg的表达量和对HBV DNA的抑制情况。在毒性实验中,茵栀苦复方对HepG2.2.15细胞的无毒浓度TC0为200mg/ml,TC50为358.5mg/ml。茵栀苦复方及其组分对2.2.15细胞培养上清液中的HBsAg都存在着不同程度的抑制作用,并呈现基本一致的规律,抑制率从第一天开始逐渐攀升,于第6天达到最高值,并由此开始下降,其中以复方高剂量为最高,与3TC比较差异显著。从抑制率的变化趋势来看,复方高剂量下降最为缓慢,药效时间维持长久。茵栀苦复方及其组分对2.2.15细胞培养上清液中的HBeAg的抑制作用,只有复方高剂量呈现比较清晰的规律,与抑制HBsAg的变化规律基本一致。其它药物的抑制率都在20%-30%左右波动,药效不显著,而且实验数据不稳定。从抑制率的变化趋势来看,复方高剂量下降较快,药效时间维持较短。结果显示复方对HBsAg的抑制作用要强于HBeAg。含药血清对2.2.15细胞上清的HBsAg抑制率的影响,其曲线显示出的规律也为第六天达到最高峰,此后逐渐下降,但是下降的趋势明显比单味药物作用的要缓,在第12天仍然可测到较高的水平。两种药物血清对HBsAg的影响无明显差异。含药血清对2.2.15细胞上清分泌的HBeAg抑制率的影响,其曲线显示出的规律与HBsAg有所不同,为第六天达到最高峰,但此后无明显下降,到第12天,抑制率还维持在较高、较稳定的水平上。两种药物血清对HBeAg的影响无明显差异。从实验结果可以看出,高剂量茵栀苦复方在体外的多项指标方面都发挥着显著的作用,与细胞对照组差异显著,茵栀苦复方对病毒DNA合成的抑制作用随着剂量的增大而增强,呈量效关系。茵栀苦复方高剂量与拉米呋啶的抑制率接近,拉米呋啶和复方高剂量组比细胞对照的HBV拷贝数少了一个指数级,疗效显著。复方的组分中苦参提取物的抑制效果最强,药效强度在复方高、低剂量之间,而茵陈提取物未显示出对HBV DNA的抑制作用,由此可以推断苦参是茵栀苦复方抗HBV DNA中是起作用的重要组分,同时可以看出复方的疗效优于三个单一组分（茵陈蒿提取物、栀子提取物和苦参提取物）的药效,但复方和各组分之间药效并不是简单的叠加关系,复方无论高、低剂量药效强度都要优于单味药。本研究也用荧光定量方法检测了含药血清对HBV DNA的抑制作用,观察茵栀苦复方在体内代谢后的含药血清对细胞的病毒复制的影响,从结果可以看出,以未含药物的阴性血清作为细胞对照,含药血清对HBV-DNA未显示明显的抑制作用。其抑制率均不超过20%。本研究运用鸭乙肝模型观察了中药复方在体内对DHBV-DNA复制的抑制作用。通过口服、腹腔注射两种给药途径,分为病毒组、3T组、低、中、高剂量组,在给药前（T0）,给药第5天（T5）、第10天（T10）和停药后第3天（P3）,计算抑制率,将以不同给药时间抑制率结果作为重复测量变量进行分析,结果表明不同给药方式之间有统计学意义,腹腔注射效果好于口服给药;给药第5天抑制率与第10天抑制率之间比较有统计学意义,而停药后3天抑制率与给药第5天抑制率之间比较无统计学意义。不同药物组之间阴性对照组和其他各组之间均有统计学意义,高剂量组、中剂量组、低剂量组之间无统计学意义,而阳性对照组除了和高剂量组无统计学意义外,与其他各组均有统计学意义。从以上结果可以看出复方药物治疗组对病毒的抑制是有效果的,腹腔注射效果好于口服给药,其中高剂量组治疗效果和阳性对照组最接近,但与阳性对照组的效果仍有一定的差距;高、中、低剂量组之间无统计学意义,可能与此次实验样本的数量较少有关,治疗的效果与剂量是否存在量效关系,需进一步增大样本量进行研究。