炎立消结肠定位包衣片的制备和作用机理研究

论文摘要

口服结肠靶向给药系统最近十多年来受到广泛重视,它可用于结肠局部病变的治疗,在蛋白、多肤类药物的口服给药上也具有广阔的应用前景。近年来溃疡性结肠炎（UC）发病率呈上升趋势,已被世界卫生组织列为现代难治疾病之一,有关其病因、发病机理、治疗药物的研究一直是该领域研究的热点,引起了国内外医药学研究人士的广泛关注。与西药相比,中医药具有辨证灵活,疗效显着,毒副作用少,复发率低等优点,但剂型的落后又严重制约了中药治疗优势的充分发挥。因此,进行中药口服结肠靶向给药系统的研究就显得尤为重要。丁香叶为木樨科植物紫丁香（syringa oblata lindl.）、洋丁香（syringavulgaris L.）和朝鲜丁香（syringa diatata Nakai）的干燥叶,在东北和华北地区分布广泛,资源丰富,是著名的观赏和园艺植物。丁香叶味苦性寒,民间将其作为传统中草药,主要用于抗菌消炎、保肝利胆等。近年来,我国的科研工作者对丁香叶的药理研究做了大量的工作,发现丁香叶具有广谱抗菌和抗病毒作用,并已收载于《黑龙江省药品标准》。丁香叶制剂炎立消胶囊、片剂收载于《中华人民共和国部颁药品标准》,主要用于治疗急性肠炎、上呼吸道感染、黄疸性肝炎、菌痢等感染性疾病,疗效显着,副作用小,基础研究较为深入。虽然丁香叶是治疗炎性肠病的有效药物,但普通制剂口服后药物成分易在胃肠道上部吸收,因此需制备成结肠靶向释药系统,以提高有效成分在结肠局部病灶的治疗浓度,减少全身吸收带来的副作用。本文选用丁香叶有效部位作为模型药物,采用丙烯酸树脂水分散体为包衣材料,制备口服结肠靶向给药系统,治疗慢性溃疡性结肠炎。本文以中医药理论为指导,采用化学有效成分和药理活性双重指标研究丁香叶有效部位提取工艺,建立检测内在质量的定量方法,研究制备了pH依赖-时间控释型结肠定位包衣片,使药物在结肠段精确释放。采用AB-8大孔吸附树脂对丁香叶中丁香苦苷类成分进行提取精制,以丁香苦苷为考察指标,建立HPLC分析方法,考察了影响指标性成分提取率的工艺因素。丁香叶经水提取,70%乙醇沉淀,以AB-8型大孔树脂为吸附剂,4BV的水洗脱除去杂质后,收集5BV的50%乙醇洗脱液为最佳工艺条件。该方法对有效成分的保留率高,且原材料和能耗低,经济实用。大孔吸附树脂分离工艺可作为富集丁香苦苷类成分的有效方法,为丁香叶药材的质量控制和新型给药系统的研究奠定基础。采用滚转包衣机多层薄膜包衣技术制备结肠定位包衣片,以羟丙甲纤维素HPMC作为隔离层,pH敏感型丙烯酸树脂Eudragit L30D-55与Eudragit S100混合包衣液作为肠溶层,渗透型丙烯酸树脂Eudragit RL30D和EudragitRS30D混合液作为缓释层,以柠檬酸三乙酯作为增塑剂,滑石粉作为抗粘剂,通过正交实验进行处方优化,研究包衣片在模拟人体胃肠道环境中的释药速率。结果表明,最佳包衣处方:隔离层增重1.2%;肠溶层组成Eudragit L30D-55:S100（1:5）,包衣增重5%;缓释层组成（1:1.5）,包衣增重2%。包衣片在0.1moL·L-1盐酸溶液中2小时无药物释放,在pH6.8的磷酸盐缓冲液中3小时药物释放低于10%,在pH7.5的磷酸盐缓冲液中呈缓慢释放,12小时内药物释放量在70%左右,累积释药百分率达到标示量的80%以上。为了进行家兔体内药物动力学研究,建立了简单、快速、灵敏的血浆中丁香苦苷浓度HPLC检测方法。丁香苦苷浓度在0.524～52.4μg·mL-1范围内具有良好的线性关系。以未包衣片芯为对照,研究6只健康家兔口服PH依赖-时间控释型结肠定位包衣片的药物动力学。结果表明,结肠定位包衣片的体内吸收显着低于未包衣片芯（P＜0.01）,PH依赖-时间控释型结肠定位包衣片和未包衣片芯的丁香苦苷AUC0-36分别为75.306 mg/L·h和202.383 mg/L·h,二者间不具生物等效性。pH依赖-时间控释结肠定位包衣片的体内吸收时滞为4.6h,与体外释药时滞基本相同。主要药代动力学参数证明,结肠定位包衣片可显着减少全身吸收,具有较好结肠靶向性。本研究采用2,4,6,—三硝基苯磺酸建立大鼠溃疡性结肠炎（UC）模型,通过HE染色观察结肠病理改变的变化情况,用原位末端标记检测结肠粘膜细胞凋亡,用免疫组化法检测结肠粘膜Fas,Bcl-2,Bax,Caspase-3和核转录因子NF-κBp65的蛋白表达;采用β-actin作为管家基因,绘制了该基因定量PCR的标准曲线,建立了实时定量PCR的方法来检测目的基因Fas,Bcl-2,Caspase-3和核转录因子NF-κBp65的表达水平,研究丁香叶有效部位对UC的治疗作用的分子生物学机制,特别是通过观察它们对UC大鼠细胞凋亡相关信号途径的影响,为揭示中药治疗溃疡性结肠炎的基本规律提供实验基础和理论依据,为临床用药提供理论指导。

论文目录

• 英汉缩略语对照表
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1.项目研究开发的目的、意义
• 2.口服结肠靶向给药系统的作用原理及国内外研究现状
• 3.立论依据与研究内容
• 第一章 丁香叶有效部位的提取与精制工艺研究
• 第一节 丁香叶提取工艺研究
• 1.实验材料
• 1.1 仪器
• 1.2 药材及试剂
• 2.方法与结果
• 2.1 丁香苦苷的定量方法
• 2.2 丁香叶提取工艺优化设计
• 2.3 醇沉工艺条件
• 第二节 大孔吸附树脂对丁香叶中丁香苦苷类成分富集工艺研究
• 1 实验材料
• 1.1 仪器
• 1.2 药材及试剂
• 2.方法与结果
• 2.1 丁香苦苷的定量方法
• 2.2 丁香叶供试品溶液的制备
• 2.3 丁香叶供试品溶液中丁香苦苷含量测定
• 3.大孔吸附树脂富集工艺研究
• 3.1 大孔吸附树脂预处理
• 3.2 大孔吸附树脂的强化再生处理
• 3.3 树脂含水量的测定
• 3.4 静态吸附-解吸实验筛选树脂型号
• 3.5 树脂吸附性能研究
• 3.6 pH值与吸附量的关系
• 3.7 洗脱剂浓度的考察
• 3.8 洗脱剂用量的考察
• 3.9 工艺验证
• 4.讨论
• 第二章 炎立消结肠定位包衣片处方设计前研究
• 1.仪器与试剂
• 1.1 仪器
• 1.2 试剂
• 2.方法与结果
• 2.1 丁香苦苷的定量方法
• 2.2 丁香叶大孔吸附树脂纯化物中丁香苦苷的含量测定
• 2.3 大孔吸附树脂纯化物在常用溶剂中的溶解性考察
• 2.4 大孔吸附树脂纯化物表观溶解度的测定
• 2.5 大孔吸附树脂纯化物油/水分配系数的测定
• 2.6 大孔吸附树脂纯化物流动性考察
• 2.7 大孔吸附树脂纯化物与辅料相互作用
• 2.8 辅料对紫外最大吸收波长的影响
• 3.讨论
• 第三章 炎立消结肠定位包衣片片芯的成型工艺研究
• 1.实验仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料
• 2.方法与结果
• 2.1 压片方法的选择
• 2.2 片芯处方的单因素考察
• 2.3 制粒粒度的选择
• 3.颗粒物理性质考察
• 3.1 颗粒的含水量
• 3.2 休止角的测定
• 3.3 堆密度的测定
• 4.压片工艺的考察
• 4.1 压片压力对片芯的影响
• 4.2 冲模的选取
• 5.片芯处方的确定
• 6.片芯成型工艺
• 7.工艺验证实验
• 8.讨论
• 第四章 炎立消结肠定位包衣片的制备工艺与体外释放研究
• 1.实验材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料
• 2.方法与结果
• 2.1 片芯处方与工艺研究
• 2.2 包衣工艺研究与包衣液配制
• 2.3 包衣方法
• 2.4 炎立消结肠定位包衣片体外分析方法的建立
• 2.5 包衣处方的筛选
• 2.6 包衣液处方的优化
• 2.7 包衣工艺验证
• 2.8 结肠定位包衣片释放度的评价方法-相似因子法
• 2.9 影响结肠定位包衣片释药的因素
• 3.炎立消结肠定位包衣片释药机理的研究
• 3.1 释药时滞
• 3.2 药物的释放
• 3.3 体外释药动力学方程的拟合
• 4.讨论
• 4.1 隔离层
• 4.2 肠溶层
• 4.3 缓释层
• 4.4 包衣成膜原理和主要影响因素
• 5.结论
• 第五章 炎立消结肠定位包衣片在家兔体内的药物动力学研究
• 1.实验材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料
• 1.3 受试动物
• 1.4 药代动力学分析软件
• 2.方法与结果
• 2.1 试验设计
• 2.2 丁香苦苷在生物样品中的测定方法及评价
• 2.3 炎立消结肠定位包衣片在家兔体内的药物动力学研究
• 2.3.1 受试制剂中丁香苦苷在家兔体内不同时间的血药浓度测定结果
• 2.3.2 参比制剂中丁香苦苷在家兔体内不同时间的血药浓度測定结果
• 2.3.3 受试制剂和参比制剂中丁香苦苷在家兔体内的药代动力学实验结果
• 2.3.4 炎立消结肠定位包衣片以未包衣片芯为参比制剂的相对生物利用度研究
• 2.3.5 炎立消结肠定位包衣片的体内外相关性评价
• 3.讨论
• 3.1 血药浓度数据处理
• 3.2 相对生物利用度研究
• 第六章 丁香叶有效部位对溃疡性结肠炎大鼠模型作用机理的研究
• 实验一 大鼠溃疡性结肠炎（UC）动物模型的建立与评价
• 1.实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2.实验方法
• 2.1 动物分组
• 2.2 模型建立
• 2.3 观察项目与方法
• 2.4 标本采集与处理
• 2.5 病理组织切片（HE染色）制备
• 2.6 结肠组织匀浆制备
• 2.7 结肠组织MPO检测
• 3.结果与讨论
• 3.1 溃疡性结肠炎动物模型的建立
• 3.2 溃疡性结肠炎（UC）大鼠一般情况和体重的观察
• 3.3 溃疡性结肠炎（UC）大鼠肠道损伤大体形态及组织病理学的观察
• 3.4 溃疡性结肠炎（UC）大鼠结肠组织中MPO的变化
• 实验二 丁香叶有效部位对溃疡性结肠炎大鼠细胞凋亡的影响
• 1.实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 药物
• 1.3 主要试剂和试剂盒
• 1.4 仪器
• 2.实验方法
• 2.1 药物制备方法
• 2.2 实验动物分组与给药
• 2.3 标本采集及处理
• 2.4 结肠组织细胞凋亡检测（TUNEL法）
• 2.5 统计学分析
• 3.细胞凋亡检测结果
• 4.讨论
• 实验三 丁香叶有效部位对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织Fas、Bax、Bcl-2、Caspase-3和NF-KBp65蛋白表达的影响
• 1.实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 药物
• 1.3 主要试剂和试剂盒
• 1.4 仪器
• 2.实验方法
• 2.1 动物模型制备
• 2.2 药物制备方法
• 2.3 实验动物分组与给药
• 2.4 标本采集及处理
• 2.5 免疫组化染色检测主要操作步骤
• 2.6 Fas、Bax、Bcl-2、Caspase-3和NF-κ Bp65蛋白表达的半定量分析
• 2.7 统计学分析
• 3.结果
• 3.1 免疫组织化学检测大鼠结肠粘膜Fas蛋白表达
• 3.2 免疫组织化学检测大鼠结肠粘膜Bax和Bcl-2蛋白表达
• 3.3 免疫组织化学检测大鼠结肠粘膜Caspase-3蛋白表达
• 3.4 免疫组织化学检测大鼠结肠粘膜NF-κ Bp65蛋白表达
• 实验四 丁香叶有效部位对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织Fas、Bcl-2、Caspase-3和NF-KBp65 mRNA表达的影响
• 1.实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 受试药物
• 1.3 主要试剂和试剂盒
• 1.4 实验仪器
• 2.实验方法
• 2.1 动物模型制备及给药方案
• 2.2 标本采集及处理
• 2.3 实验步骤
• 2.3.1 大鼠结肠组织中总RNA的抽提（Trizol法）
• 2.3.2 组织RNA提取注意事项
• 2.3.3 RNA样品完整性及纯度检测
• 2.3.4 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）合成cDNA
• 2.3.5 引物和探针设计
• 2.3.6 标准曲线的制备
• 2.3.7 重复性的测定
• 2.3.8 稳定性的测定
• 2.3.9 定量PCR检测
• 2.4 统计学分析
• 3.结果
• 3.1 实时定量PCR检测溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中Fas、BcL-2、Caspase-3和NF-κ Bp65模版的荧光扩增曲线图谱
• 3.2 实时定量PCR检测溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中Fas、BcL-2、Caspase-3和NF-κ Bp65 mRNA的基因表达Ct值和拷贝数
• 4.讨论
• 4.1 实时荧光定量PCR
• 4.2 实时荧光定量PCR的种类
• 4.3 实时荧光定量PCR的工作原理
• 4.4 实时荧光定量PCR的定量原理
• 4.5 实时荧光定量PCR的特点
• 全文参考文献
• 附表
• 致谢
• 个人简历