西瓜病毒病的田间调查及多重RT-PCR同步检测

西瓜病毒病的田间调查及多重RT-PCR同步检测

论文摘要

我国是西瓜的主要生产国之一,其中西北地区为我国重要的优质产区。但在西瓜的生产上受到多种病害的影响,致使西瓜大量减产,部分田块甚至绝收,严重影响了瓜农的种植积极性。据报道,侵染西瓜的病毒主要有:西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV) ,而且在田间病毒会经常发生复合感染。2007年至2008年对陕西省杨凌、礼泉、韩城、扶风、周至和武功6个西瓜种植区的西瓜植株进行调查,观察并记录了西瓜病毒病的发生情况、危害程度以及病害发生规律,调查发现在陕西西瓜病毒病发生普遍,危害严重,而且单一症状少,复合侵染的症状较多。症状类型主要有花叶、皱缩、泡斑、植株矮小、卷叶等,不同地区的典型症状又不尽相同,调查结果如下:(1)所调查的五个地区的发病瓜叶上均出现花叶症状,早期即显症,随着病情的发展和植株的发育,顶部嫩叶逐渐呈现深绿、浅绿相间的斑驳花叶,且有成片发病现象。(2)除扶风以外,其他地区的发病瓜叶上均有疱状突起,不同西瓜品种间泡斑严重程度存在差异。(3)杨凌和周至的发病瓜叶上有不同程度的皱缩畸形,后期叶片坏死。(4)韩城、扶风和周至三地的发病瓜苗出现植株矮小的症状,而且发病植株叶片小,严重的呈蕨叶形或鸡爪状。(5)卷叶发生情况较轻,只在扶风零星发生。为了保证西瓜生产的产量和质量,准确鉴定西瓜病害,在西瓜生产上急需一种较为准确、灵敏、和快速的病害检测方法。本研究针对陕西省西瓜病毒病的发生现状,在利用单重RT-PCR(sRT-PCR)技术检测西瓜病害的基础上,对多重RT-PCR体系各成分及循环参数进行摸索和优化,建立了一种能同时检测ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV 5种病毒的多重RT-PCR(mRT-PCR)技术体系。首先根据5种病毒的核苷酸保守区序列,设计特异性引物对,然后从影响多重RT-PCR扩增的Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、退火温度、延伸时间、循环次数等多方面进行优化,成功的在一个体系中对同时被ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV5种病毒复合侵染的西瓜材料进行多重RT-PCR扩增,得到了542、485、410、354和293bp 5条特异性且大小与试验设计相符合的条带。序列同源性分析验证了多重RT-PCR结果的可靠性。该体系已应用于实际,实现了对侵染西瓜的5种病毒的同时检测,极大的提高了检测效率,降低了检测成本,体现了多重RT-PCR的优越性。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 侵染西瓜的5 种主要病毒
  • 1.1.1 西瓜花叶病毒
  • 1.1.2 小西葫芦黄花叶病毒
  • 1.1.3 黄瓜花叶病毒
  • 1.1.4 南瓜花叶病毒
  • 1.1.5 烟草花叶病毒
  • 1.2 西瓜病毒检测技术的研究
  • 1.2.1 生物学检测方法
  • 1.2.2 血清学检测法
  • 1.2.3 电子显微镜检测法
  • 1.2.4 分子生物学检测法
  • 1.3 多重RT-PCR 技术的研究进展
  • 1.3.1 多重RT-PCR 技术及其本原理
  • 1.3.2 多重RT-PCR 技术在生命科学研究中的应用
  • 1.3.3 多重RT-PCR 的最新进展
  • 1.4 本研究的目的意义和技术路线
  • 第二章 材料和方法
  • 2.1 试验材料
  • 2.1.1 毒源
  • 2.1.2 仪器
  • 2.1.3 菌种、试剂
  • 2.1.4 溶液配置
  • 2.2 试验方法
  • 2.2.1 田间病害调查及毒源采集
  • 2.2.2 感染病毒的西瓜叶片总RNA 的提取
  • 2.2.3 引物的设计与筛选
  • 2.2.4 两步法单重RT-PCR 扩增5 种病原
  • 2.2.5 多重RT-PCR 反应体系的摸索和优化
  • 2.2.6 目的片段的克隆
  • 2.2.7 重组质粒的鉴定
  • 2.2.8 目的片段的序列测定和同源性分析
  • 2.2.9 多重RT-PCR 检测方法的实际应用
  • 第三章 结果与分析
  • 3.1 西瓜病毒病的田间调查
  • 3.2 总核酸的提取与检测
  • 3.3 两步法单重PCR 电泳检测结果
  • 3.4 多重RT-PCR 检测结果及优化
  • 3.4.1 多重RT-PCR 反应体系的优化
  • 3.4.2 多重RT-PCR 反应循环条件的优化
  • 3.5 PCR 产物序列分析
  • 3.6 多重RT-CR 对西瓜病毒检测性能测定
  • 第四章 讨论
  • 4.1 两步法多重RT-PCR 技术要点
  • 4.2 传统生物学方法与多重RT-PCR 检测法的比较
  • 4.3 ELISA 检测法与多重RT-PCR 检测法比较
  • 4.4 一步法RT-PCR 与两步法RT-PCR 检测体系的比较
  • 第五章 结论与研究设想
  • 5.1 主要结论
  • 5.2 进一步的研究设想
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介
  • 硕士期间发表论文
  • 相关论文文献

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