西瓜病毒病的田间调查及多重RT-PCR同步检测

论文摘要

我国是西瓜的主要生产国之一,其中西北地区为我国重要的优质产区。但在西瓜的生产上受到多种病害的影响,致使西瓜大量减产,部分田块甚至绝收,严重影响了瓜农的种植积极性。据报道,侵染西瓜的病毒主要有:西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus,SqMV）、小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV） ,而且在田间病毒会经常发生复合感染。2007年至2008年对陕西省杨凌、礼泉、韩城、扶风、周至和武功6个西瓜种植区的西瓜植株进行调查,观察并记录了西瓜病毒病的发生情况、危害程度以及病害发生规律,调查发现在陕西西瓜病毒病发生普遍,危害严重,而且单一症状少,复合侵染的症状较多。症状类型主要有花叶、皱缩、泡斑、植株矮小、卷叶等,不同地区的典型症状又不尽相同,调查结果如下:（1）所调查的五个地区的发病瓜叶上均出现花叶症状,早期即显症,随着病情的发展和植株的发育,顶部嫩叶逐渐呈现深绿、浅绿相间的斑驳花叶,且有成片发病现象。（2）除扶风以外,其他地区的发病瓜叶上均有疱状突起,不同西瓜品种间泡斑严重程度存在差异。（3）杨凌和周至的发病瓜叶上有不同程度的皱缩畸形,后期叶片坏死。（4）韩城、扶风和周至三地的发病瓜苗出现植株矮小的症状,而且发病植株叶片小,严重的呈蕨叶形或鸡爪状。（5）卷叶发生情况较轻,只在扶风零星发生。为了保证西瓜生产的产量和质量,准确鉴定西瓜病害,在西瓜生产上急需一种较为准确、灵敏、和快速的病害检测方法。本研究针对陕西省西瓜病毒病的发生现状,在利用单重RT-PCR（sRT-PCR）技术检测西瓜病害的基础上,对多重RT-PCR体系各成分及循环参数进行摸索和优化,建立了一种能同时检测ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV 5种病毒的多重RT-PCR（mRT-PCR）技术体系。首先根据5种病毒的核苷酸保守区序列,设计特异性引物对,然后从影响多重RT-PCR扩增的Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、退火温度、延伸时间、循环次数等多方面进行优化,成功的在一个体系中对同时被ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV5种病毒复合侵染的西瓜材料进行多重RT-PCR扩增,得到了542、485、410、354和293bp 5条特异性且大小与试验设计相符合的条带。序列同源性分析验证了多重RT-PCR结果的可靠性。该体系已应用于实际,实现了对侵染西瓜的5种病毒的同时检测,极大的提高了检测效率,降低了检测成本,体现了多重RT-PCR的优越性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 侵染西瓜的5 种主要病毒
• 1.1.1 西瓜花叶病毒
• 1.1.2 小西葫芦黄花叶病毒
• 1.1.3 黄瓜花叶病毒
• 1.1.4 南瓜花叶病毒
• 1.1.5 烟草花叶病毒
• 1.2 西瓜病毒检测技术的研究
• 1.2.1 生物学检测方法
• 1.2.2 血清学检测法
• 1.2.3 电子显微镜检测法
• 1.2.4 分子生物学检测法
• 1.3 多重RT-PCR 技术的研究进展
• 1.3.1 多重RT-PCR 技术及其本原理
• 1.3.2 多重RT-PCR 技术在生命科学研究中的应用
• 1.3.3 多重RT-PCR 的最新进展
• 1.4 本研究的目的意义和技术路线
• 第二章 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 毒源
• 2.1.2 仪器
• 2.1.3 菌种、试剂
• 2.1.4 溶液配置
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 田间病害调查及毒源采集
• 2.2.2 感染病毒的西瓜叶片总RNA 的提取
• 2.2.3 引物的设计与筛选
• 2.2.4 两步法单重RT-PCR 扩增5 种病原
• 2.2.5 多重RT-PCR 反应体系的摸索和优化
• 2.2.6 目的片段的克隆
• 2.2.7 重组质粒的鉴定
• 2.2.8 目的片段的序列测定和同源性分析
• 2.2.9 多重RT-PCR 检测方法的实际应用
• 第三章 结果与分析
• 3.1 西瓜病毒病的田间调查
• 3.2 总核酸的提取与检测
• 3.3 两步法单重PCR 电泳检测结果
• 3.4 多重RT-PCR 检测结果及优化
• 3.4.1 多重RT-PCR 反应体系的优化
• 3.4.2 多重RT-PCR 反应循环条件的优化
• 3.5 PCR 产物序列分析
• 3.6 多重RT-CR 对西瓜病毒检测性能测定
• 第四章 讨论
• 4.1 两步法多重RT-PCR 技术要点
• 4.2 传统生物学方法与多重RT-PCR 检测法的比较
• 4.3 ELISA 检测法与多重RT-PCR 检测法比较
• 4.4 一步法RT-PCR 与两步法RT-PCR 检测体系的比较
• 第五章 结论与研究设想
• 5.1 主要结论
• 5.2 进一步的研究设想
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 硕士期间发表论文