一氧化氮（NO）在拟南芥抗病信号途径中的调控机理

论文摘要

一氧化氮（NO）是迄今发现的自然界中十个最小的化学分子之一,是一种易扩散的生物活性分子。NO在原生动物、细菌、酵母、动物和人体的作用机制已有大量研究。NO不仅在人体和哺乳动物的血管松弛、神经传导以及先天性免疫反应等动物生理代谢过程中是一种关键的信号分子,而且被认为是一种新的植物生长调节物质参与植物的生长发育。研究者发现NO在植物的抗病防御反应中也发挥着重要作用。目前NO药物学的作用在植物抗病反应中已有较多报道。然而,NO与SA、JA和ET植物激素相互作用如何调节植物抗病性的分子机制不清楚。本论文将利用我们已获得的多种突变体材料,采用反向遗传学,分子生物学和药物学等技术,重点解析NO与SA、JA和ET互作在植物抗病分子机制中作用。实验研究结果表明:（1）半定量RT-PCR分析发现NO含量升高的突变体cue1植株中组成型地表达抗病相关基因PR1和PDF1.2。在cue1中SA的含量大幅上升,细菌病原计数实验表明cue1对Pseudomonas syringae pv.macicola ES4326具有一定的抗性。用不同浓度NO供体SNP处理WT（Col）,PR1和PDF1.2基因的表达与SNP的浓度有一定的依赖性。在cue1npr1和cue1nahG双突变体中,植株叶片NO含量与cue1基本一样,但是PR1基因的表达完全受到抑制,并且对P.s.m.ES4326表现出完全的感病。这些实验表明NO对抗病基因PR1的诱导是通过SA和NPR1来完成的。（2）外源NO供体SNP处理乙烯不敏感突变体ein2和ein3不能诱导PDF1.2的表达,而处理茉莉酸不敏感突变体jar1却能诱导PDF1.2的表达。半定量RT-PCR结果显示,双突变体cue1jar1不能阻断PDF1.2的表达,而双突变体cuelein2却阻断了PDF1.2的表达。荧光染料DAF-2DA对双突变体cue1ein2和cue1jar1染色发现NO含量和cue1的基本一样。细菌病原计数实验表明cue1ein2和cue1jar1对P.s.m.ES4326都具有抗性。双突变体cue1ein2表现出晚花现象,而cue1jar1依旧与jar1同样表现为早花。由此可见,NO对抗病相关基因PDF1.2表达的影响是通过EIN2来起作用,而不是JAR1,但是对ein2和jar1开花影响的机制可能完全不一样。（3） SNP处理突变体eds1和eds5,结果表明对抗病基因PDF1.2和PR1表达的影响和WT基本上一样,但是NO对eds1和eds5的叶片的发育有更重要的影响,当SNP的浓度高于20μM时,它们的叶片几乎全部都出现网状叶脉。因此,NO在EDS1和EDS5的上游起作用的可能性不大,却对它们的叶片发育过程有重要的作用。本论文初步通过反向遗传学,分子生物学和药物学的方法揭示了NO对抗病信号途径SA途径和JA/ET途径的调控作用。NO对SA抗病信号途径的标志基因PR1的表达调控主要是通过SA和NPR1来实现的,而对JA/ET抗病信号途径的标志基因PDF1.2的表达调控是通过EIN2和EIN3来完成的,而不是JAR1。这是首次通过遗传学的方法阐明NO在植物抗病信号途径中的机理研究,同时也提出了NO在JA/ET信号途径中的新观点和证据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物抗病基因-R基因
• 1.1.1 病原菌无毒基因
• 1.1.2 植物抗病基因
• 1.1.3 拟南芥抗病基因的克隆
• 1.1.4 抗病基因产物分析
• 1.2 植物抗病中的信号分子及其作用
• 1.2.1 水杨酸及其信号分子作用
• 1.2.1.1 水杨酸的生物合成
• 1.2.1.2 SA的生物学功能
• 1.2.2 茉莉酸（JA）及其信号分子作用
• 1.2.2.1 茉莉酸的结构和生物合成
• 1.2.2.2 茉莉酸（JA）的生物学功能
• 1.2.3 乙烯（ET）及其信号分子作用
• 1.2.3.1 乙烯的生物合成
• 1.2.3.2 乙烯的生物学功能
• 1.2.4 促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在抗病信号传递中的作用
• 1.3 一氧化氮及其在抗病信号转导中的作用
• 1.3.1 NO的化学性质
• 1.3.2 植物体内NO的产生
• 1.3.2.1 一氧化氮合酶（NOS）来源的NO
• 1.3.2.2 硝酸还原酶（NR）来源的NO
• 1.3.2.3 非酶促来源的NO
• 1.3.2.4 其他酶类来源的NO
• 1.3.3 NO的生物学功能
• 1.3.4 NO参与植物的抗逆反应
• 1.3.4.1 NO参与生物因素的胁迫响应—植物抗病反应
• 1.3.4.2 NO参与非生物因素的胁迫响应
• 1.3.5 NO和SA、JA/ET的相互作用
• 1.3.5.1 NO和SA的相互关系
• 1.3.5.2 NO和JA的相互关系
• 1.3.5.3 NO和ET之间的相互关系
• 1.3.6 NO的信号转导
• 1.3.6.1 依赖于鸟苷酸环化酶的信号通路
• 1.3.6.2 顺乌头酸酶、柠檬酸环化酶传导信号通路
• 1.3.6.3 MAPK调控效应基因表达通路
• 2O₂调控效应基因表达'>1.3.6.4 依赖和非依赖于H₂O₂调控效应基因表达
• 1.4 论文的立题依据和目标
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 载体和菌株
• 2.1.3 酶,试剂盒和各种分子生物学和化学试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物培养
• 2.2.2 cue1npr1和cue1nahG双突变体的创建
• 2.2.3 cue1ein2和cue1jar1双突变体的创建
• 2.2.4 拟南芥基因组DNA的提取
• 2.2.4.1 NAHG和NPR基因的PCR扩增
• 2.2.5 RNA制备及基因表达分析
• 2.2.5.1 植物总RNA提取及质量鉴定（Trizol法）
• 2.2.5.2 mRNA的反转录
• 2.2.5.3 PCR扩增
• 2.2.6 Pseudomonas syringae pv.maculicola ES4326接种菌液的制备及侵染实验
• 2.2.7 NO含量的分析
• 2.2.8 SA含量测定
• 第三章 实验结果与分析
• 3.1 抗病基因PR1和PDF1.2在cue1突变体的表达分析
• 3.2 cue1突变体对假单胞菌（Pseudomonas syringae pv.maculicola ES4326）侵染的抗性分析
• 3.3 NO同时能诱导SA信号途径和JA/ET信号途径抗性基因的表达
• 3.4 在cue1突变体中SA含量的测定
• 3.5 双突变体cue1npr1的创建及其形态学和遗传学的分析
• 3.6 双突变体cue1nahG的创建及其遗传分析
• 3.7 在双突变体cue1npr1和cue1nahG中NO含量的测定
• 3.8 双突变体cue1npr1和cue1nahG对假单胞菌（Pseudomonas syringae pv.maculicola ES4326）侵染的抗性分析
• 3.9 JA/ET信号途径的突变体ein2,ein3和jar1对SNP处理的表型分析
• 3.10 双突变体cue1ein2和cue1jar1的创建及其形态学和遗传分析
• 3.11 在双突变体cue1ein2和cue1jar1中NO含量的测定
• 3.12 双突变体cue1ein2和cue1jar1对假单胞菌（Pseudomonas syringae pv.maculicola ES4326）侵染的抗性分析
• 3.13 eds1和ede5突变体对SNP处理的表型分析
• 3.14 NO对病原菌侵染应答反应中的功能模型
• 第四章 讨论
• 4.1 NO参与SA信号途径
• 4.2 NO参与JA/ET信号途径
• 4.3 NO参与EDS1和EDS5的信号传递
• 第五章 结论
• 参考文献
• 发表文章情况
• 致谢