靶向沉默PLCε联合藏花素抑制膀胱癌BIU-87细胞增殖作用及机制研究

论文摘要

第一部分目的:研究藏花素对膀胱癌BIU-87细胞的抑制作用及机制,为藏花素在肿瘤治疗中的应用奠定理论基础。方法:MTT法测定藏花素抗增殖作用,FCM分析细胞周期分布,RT-PCR技术测定Cyclin D1, P27kip1mRNA表达变化,Western-blot检测Cyclin D1, P27kip蛋白表达变化。结果:藏花素对细胞生长有抑制作用,且呈时间-剂量依赖关系。FCM检测显示,藏花素可使细胞阻滞于G0/G1期;3.2mmol/L藏花素作用于BIU-87细胞48h后,RT-PCR结果显示,Cyclin D1mRNA表达明显下调,P27kipmRNA无显著变化;Western-blot结果表明Cyclin D1蛋白明显下调;P27kip1蛋白表达显著增加。结论:藏花素可抑制膀胱癌BIU-87细胞增殖,其机制可能与阻滞细胞周期于G0/G1期,抑制Cyclin D1mRNA及蛋白表达,上调P27kip1蛋白表达有关。第二部分目的:应用RNAi（RNA interference）技术靶向沉默PLCε基因后,观察联合藏花素对膀胱癌BIU-87细胞增殖的抑制作用并探讨其作用机制,为中药联合基因治疗膀胱癌拓展新思路,并为其提供理论依据。方法:通过真核细胞转染技术将pGenesil-PLCε质粒转染BIU-87细胞,实验分为5组:未转染组、pGenesil-NP阴性质粒组、pGenesil-PLCε质粒组、藏花素组、pGenesil-PLCε联合藏花素组。MTT法观察不同处理组对BIU-87细胞的生长抑制作用;流式细胞术检测细胞周期分布;RT-PCR法检测转染后PLCεmRNA及各组PCNA、CyclinD1、CyclinE和P27kip mRNA表达的变化。Western-blot检测PCNA、CyclinD1、CyclinE和P27kip蛋白表达的变化。结果: pGenesil-PLCε质粒转染可特异性抑制BIU-87细胞78.06%的PLCεmRNA表达。RNAi PLCε联合藏花素组可增强藏花素对BIU-87细胞的生长抑制作用,48h抑制率达45.30%,且与RNAi PLCε质粒组和单独应用藏花素组相比较有显著性差异（P<0.01）。FCM检测显示,藏花素可使细胞周期阻滞于G0/G1期;RT-PCR和Western-blot结果显示与未转染组比较,RNAi PLCε联合藏花素组明显下调了PCNA、CyclinE基因和蛋白的表达（P<0.05）,与RNAi PLCε质粒组、藏花素组比较有显著性差异（P <0.05）;与未转染组比较,RNAi PLCε联合藏花素组明显上调了P27kip基因和蛋白的表达（P<0.05）,与RNAi PLCε质粒组、藏花素组比较有显著性差异（P <0.05）;与未转染组比较,RNAi PLCε联合藏花素组明显下调了CyclinD1蛋白的表达（P<0.05）,与RNAi PLCε质粒组、藏花素组比较有显著性差异（P <0.05）,在基因水平上,可下调Cyclin D1 mRNA的表达,与RNAi PLCε质粒组比较有显著性差异（P <0.05）,但与藏花素组比较无显著性差异（P >0.05）。结论:与单独因素处理组比较,靶向沉默PLCε基因联合藏花素对膀胱癌BIU-87细胞的生长抑制作用明显增强,其机制可能与阻滞细胞周期于G0/G1期,下调PCNA、CyclinD1和CyclinE的表达,上调P27kip表达有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 藏花素抑制膀胱癌BIU-87 细胞增殖作用研究
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 第二部分 RNAi 沉默PLCε基因联合藏花素抑制人膀胱癌BIU-87 细胞增殖作用的研究
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附图
• 文献综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文