论文摘要
奶牛于产前2-3周至产后2-3周处于围产期。这一时期对奶牛的健康和生产性能影响极大,以能量摄入减少和能量需求增加所导致的能量负平衡为特点。奶牛酮病和脂肪肝（妊娠毒血症、肥胖综合征）是以围产期能量代谢障碍为病理学基础的常见群发疾病。甘油具有生糖作用,进入糖异生途径后不依赖限速酶的催化,可以有效缓解奶牛围产期能量负平衡。发酵法生产甘油因其污染低毒性小而受到广泛关注。本实验室拥有自主知识产权的产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1是农业部公布的允许作为饲用的益生菌,对其进行基因改造后使其甘油产量提高,将工程菌发酵液制成饲料添加剂可以同时发挥甘油和益生菌的双重作用。本试验从酵母代谢原理出发,构建NDE1基因缺失突变菌株,部分切断线粒体外NADH的脱氢反应,胞质中NADH向线粒体呼吸链的传递受到影响,最终有更多的NADH进入甘油合成通路使得甘油产量升高,为研发一种防控围产期奶牛能量代谢障碍性疾病的微生态制剂提供条件。试验1酿酒酵母NDEl缺失突变株的构建本试验以本实验室拥有自主知识产权的酿酒酵母NAU-ZH-GY1为出发菌株,利用Cre/loxP重组系统成功缺失NDEl基因一条等位基因,在原基因位置留下一个loxP位点,降低了外来基因的生物危害,与传统敲除方法相比更加准确、简便和高效。针对酿酒酵母NAU-ZH-GY1优化出最佳基因缺失电转方案,即使用]DTTBuffet（DTT 20mlM）预处理处于对数生长中期的酵母细胞30 min,外源DNA浓度控制在400 ng·μL-1,电压3 kV,电容25μF,电阻200 Ω。之后利用酵母等位基因分离及融合技术,成功构建ndel△完全缺失突变菌株NAU-ZH-GY1-ndel、△,此菌株不含任何抗性标记及大段外源无意义基因,符合相关规定对益生菌安全性的要求。工程菌构建过程采用的方法成本低廉效率高,节约了大量时间及科研经费。试验2酿酒酵母NDE1缺失突变株生物学性质研究本试验对试验1构建的酿酒酵母NAU-ZH-GY1-ndel△和出发菌株NAU-ZH-GY1进行生物学性质研究,分别对菌株的生长状况、稳定性、甘油产量、生物量和发酵液中活菌数进行测定。摇瓶发酵试验结果表明两个菌株在生长状况和活菌数方面无显著差异,酿酒酵母NAU-ZH-GY1-ndel△遗传性质稳定。受基因缺失影响,酿酒酵母NAU-ZH-GY1-ndel△生物量与出发菌株相比下降了17.1%,差异显著（p<0.05）。 酿酒酵母NAU-ZH-GY1-ndel△甘油产量为26.61 g.L-1,比出发菌株提高了12.9%,与出发菌株组相比差异显著（p<0.05）。