论文摘要
研究背景脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）一直是医学领域最棘手的问题之一,其导致损伤平面以下的机体部分与大脑的联系中断,损伤平面以下感觉、运动、括约肌功能永久性障碍,目前仍无有效的治疗方法。既往认为,中枢神经系统损伤后其再生、修复和功能恢复是绝对不可能的。1981年神经学家在基础研究中证实中枢神经损伤后的神经结构修复是可能的,掀起了各国学者对脊髓修复研究的又一次热潮。SCI后轴突再生障碍的原因相当复杂,其主要原因有:（1）对脊髓的直接损伤及继发炎症使脊髓内功能神经元大量坏死或凋亡且神经元再生困难:（2）脊髓损伤后暴露的髓鞘相关抑制分子、轴突生长抑制性蛋白的大量分泌和释放及继发形成的胶质瘢痕阻碍了轴突的生长和正确连接;（3）损伤造成局部细胞凋亡,致使细胞分泌的神经营养因子减少,破坏了神经元修复和支持轴突再生的有利微环境。SCI修复机制十分复杂,SCI启动了各种有碍于脊髓再生的基因和调控基因,因而针对单一阻碍脊髓再生因素的干预往往作用有限。目前SCI的修复研究主要集中在以下几个方面:（1）药物治疗:如传统的大剂量皮质类固醇激素（甲基强的松龙）的冲击治疗,可以有效的减轻脊髓的继发性炎症损伤,保护并防止残存的损伤神经元进一步凋亡。目前研究的氯化锂（LiCl）、免疫抑制剂FK506等除了可以保护损伤神经元外,还可以有效的促进损伤轴突再生。（2）细胞移植:细胞移植是目前研究的热点,其原理是利用某些种子细胞可以分泌多种神经营养、黏附和趋化因子,营养并保护损伤神经元、诱导轴突再生及再髓鞘化来修复SCI。既往的研究已为SCI修复提供了较成熟的种子细胞,如:胚胎干细胞（ESCs）、雪旺氏细胞（SCs）、嗅鞘细胞（OECs）、神经干细胞（NSCs）、骨髓间充质干细胞（BMSCs）、脐血干细胞（UCBCs）等,大量研究证实细胞移植均能够在一定程度上促进脊髓神经功能的恢复。（3）组织移植:随着组织工程学（tissue engineering）的飞速发展,一种更先进的SCI修复理念逐步形成,即修复SCI必须包括组织水平上的重建,整合SCI治疗研究的各种有效策略,在诱导轴突定向再生的同时,减少局部胶质瘢痕形成。目前,应用于脊髓的组织工程支架主要有两种,一种为人工合成可降解高分子生物材料,如:聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等,另一种为自体或异体组织移植,如异体胚胎脊髓组织、自体肌纤维支架、游离周围神经（free peripheral nerves,FPN）或带血管蒂的游离周围神经（vascul-arized peripheral nerve,VPN）组织移植修复脊髓损伤,也取得了一定的修复效果。（4）改善脊髓损伤局部微环境:SCI后轴突再生困难的另一关键因素就是适宜轴突再生的微环境遭到破坏,各种不利于轴突再生的髓磷脂源性蛋白（myelin,MAG,Nogo-A,Omgp）轴突再生抑制分子大量分泌,而各种神经营养因子（BDNF、GDNF、NGF、NT3等）的缺乏及胶质瘢痕形成阻碍了轴突再生。为此,抑制不利抑制因子（IN-1抗体）、提高有利营养因子（BDNF、GDNF等）,改善局部微环境成为目前研究重点。（5）联合治疗:采取联合不同作用机制的治疗方法,更好的发挥协同作用来促进SCI后神经修复。如采用组织工程方法将种子细胞复合到人工合成高分子聚合材料或外周神经组织制成的支架后移植,或利用基因工程方法将多种神经营养因子的基因片段转染到种子细胞中,制成可分泌特定营养因子的基因工程细胞来修复SCI均获得了令人欣慰的研究成果。因此,本研究拟应用GDNF基因修饰OECs移植和微泵局部定点持续给予轴突生长抑制蛋白抗体IN-1来修复SCI,观察该方法对SCI后神经再生和脊髓修复的影响,并探讨其促进脊髓修复的可能作用机制。目的1.观察嗅鞘细胞（OECs）与神经干细胞（NSCs）共培养并诱导神经细胞定向分化成神经元的效果,为脊髓损伤后的细胞联合移植提供理论依据。2.探讨在构建大鼠脊髓全横断模型过程中,大鼠的性别对模型及脊髓损伤后后肢自发性功能恢复有无影响。3.构建携带有GDNF基因的慢病毒载体,并在体外观察慢病毒载体是否可以有效的感染OECs及感染的OECs是否能够长期稳定表达GDNF。4.探讨在体移植GDNF修饰的OECs联合轴突生长抑制蛋白抗体IN-1是否有良好的脊髓损伤修复作用。方法1.分别从3月龄SD大鼠的嗅球和新生乳鼠的海马中分离OECs及NSCs,进行体外分离、培养及鉴定。纯化后的OECs与NSCs共培养,诱导NSCs分化。2.构建大鼠胸髓（T10）全横断模型,观察脊髓损伤后后肢自发性功能恢复的规律和特点,并比较性别差异对脊髓横断模型及自发性功能恢复的影响。3.采用基因克隆及分子生物学方法构建带有GDNF基因的减毒HIV慢病毒载体,并体外转染嗅鞘细胞（OECs）,利用免疫印迹法（Westernblot）来判定转染后的OECs是否可以长期稳定的表达GDNF。4.50只成年雌性SD大鼠,制备中胸髓全横断伤模型,应用渗透压微泵在脊髓损伤局部蛛网膜下腔连续给入IN-1,同时脊髓损伤局部移植GDNF修饰的OECs。通过免疫组化染色的方法,观察损伤局部神经元的残留及神经纤维的表达和分布;通过皮质脊髓束和脊髓顺（逆）行追踪,观察皮质脊髓束和脊髓神经纤维的再生与分布;通过BBB评分明确后肢运动功能恢复的程度,并以此来评价治疗措施对脊髓损伤修复效果。结果1.体外培养、纯化OECs的纯度可达到93%,NSCs自然分化为神经元的分化率约为4%,纯化后的OECs与NSCs共培养,诱导NSCs分化为神经元的分化率约为23%。2.胸髓T10全横断的雌、雄大鼠在术后死亡率及后肢自发性功能恢复BBB评分上无统计学差异,所有动物的后肢运动BBB评分在各个时间的评分都非常接近,在术后4周达到了7～8分左右,并且在以后的时间里维持在8分的水平不再增加。但术后泌尿系统的并发症,雌性大鼠明显少于雄性大鼠,且易于术后护理。3.带有GDNF基因的减毒HIV慢病毒载体在体外可以有效的转染嗅鞘细胞（OECs）,转染率可达67%,转染后的OECs长期存活,并稳定表达GDNF。4.术后8周可观察到Hoechst标记的嗅鞘细胞在体内存活并在脊髓内迁移。FITC荧光标记NF-200阳性的神经纤维,在IN-1组和对照组可见脊髓残端萎缩,未见轴突再生;GDNF-OECs组和OECs组可见脊髓损伤区杂乱无序的再生轴突,但无连续性神经纤维通过损伤区;GDNF-OECs+IN-1组可见大量再生轴突,有连续性神经纤维通过损伤区。荧光金逆行脊髓追踪显示GDNF-OECs+IN-1组在大脑皮质中有少量被荧光金标记的神经锥体细胞,而GDNF-OECs组偶见被荧光金标记的神经锥体细胞,其余三组在大脑皮之中未见被荧光金标记的神经锥体细胞。后肢功能运动BBB评分除对照组和IN-1组间无统计学差异外,各组间均有显著性差异。结论1.嗅鞘细胞可以有效的诱导神经干细胞向神经元方向分化。2.脊髓横断大鼠的自发性后肢运动功能恢复可达到并维持在BBB评分8分的水平,大鼠术后死亡率及自发性后肢运动功能恢复BBB得分与性别无关,因术后护理上雌性大鼠优于雄性大鼠,故建议应用雌性大鼠构建脊髓全横断模型。3.携带有GDNF基因的慢病毒载体在体外可以有效地感染OECs,感染的OECs能够长期稳定表达GDNF。4.在体移植GDNF修饰OECs联合轴突生长抑制蛋白抗体IN-1修复脊髓损伤,可以保护残存的神经元,促进皮质脊髓束神经轴突再生,引导再生轴突通过损伤区,能部分改善后肢运动功能。
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标签：脊髓损伤论文; 嗅鞘细胞论文; 胶质源性神经营养因子论文; 轴突生长抑制蛋白抗体论文; 细胞移植论文; 评分论文;