论文摘要
目的:肝炎是严重危害人类生命健康的疾病,以病毒性肝炎为最多见。近年来自身免疫性肝炎也越来越多地受到人们的关注,这两大类型肝炎的共同特征是免疫因素起主导作用,由于肝炎病毒蛋白在肝细胞表面的表达或自身抗体的出现,使淋巴细胞能够识别杀伤自身肝细胞。JBP485 （Cyclo-trans-4-L-hydroxyprolyl-L-serine,环反式-4左旋-羟脯氨酰丝氨酸）是从人胎盘水解产物Laennec中提取出来的一种二肽,研究已证实JBP485具有潜在的抗肝炎活性。本实验通过体外方法研究JBP485的直接肝细胞保护作用及其可能的作用机制,为JBP485的开发应用提供新的实验证据及理论依据。方法:取雌性Wistar大鼠肝细胞进行原代培养,构建两组体外肝细胞损伤模型及淋巴细胞增殖干预实验,观察JBP485对刀豆球蛋白A （Concanavalin A, Con A）导致的肝细胞损伤是否具有保护作用,同时观察JBP485对淋巴细胞的增殖是否具有抑制作用。（1）模型I:采用50μg/ml Con A直接导致肝细胞损伤。分为对照组、模型I组、JBP485处理组,每组设3个复孔。25μM JBP485与肝细胞温孵1小时后加入50μg/ml Con A。（2）模型II:20μg/ml Con A预处理的肝细胞与20μg/ml Con A预刺激的自体脾淋巴细胞进行共培养8小时。分为正常组、对照组、模型II组、JBP485处理组,每组设3个复孔。25μM JBP485与肝细胞温孵1小时后加入20μg/ml Con A作用24小时,脾淋巴细胞用Con A预刺激48小时,两种细胞进行联合培养之前分别清洗两次,JBP485以同样的浓度出现在共培养体系中。对于两个模型组,作用时间结束后收集培养上清液测定谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）的活性及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量;用琼脂糖凝胶电泳进行DNA片段分析;用RT-PCR、细胞免疫化学法分析caspase-3的表达情况。（3） ICAM-1诱导/抑制实验,把20μg/ml Con A预刺激48小时的脾淋巴细胞培养上清液加入到正常无血清培养的肝细胞中,诱导肝细胞表达ICAM-1,JBP485于脾细胞培养基加入前1小时加入肝细胞,用RT-PCR、细胞免疫化学法分析ICAM-1的表达情况。（4）用96孔板培养脾淋巴细胞,细胞密度1.5×106cells/ml,Con A终浓度5μg/ml,作用时间60小时。分为空白组（只加培养基无细胞）、阳性对照组（5μg/ml Con A）、JBP485处理组,每组设3个复孔。用MTT法测定各组OD值。结果:（1） Con A对肝细胞产生浓度依赖的直接细胞毒性作用;（2） JBP485能够明显抑制Con A直接导致的肝细胞毒性,与模型I比较,JBP485处理组的培养上清液中AST、LDH的活性明显降低（ p<0.01; p<0.05）,TNF-α的含量也减少（p<0.01）;（3） JBP485能够明显抑制Con A预处理的肝细胞与Con A预刺激的自体脾淋巴细胞相互作用产生的肝细胞毒性作用,与模型II比较,JBP485处理组的培养上清液中AST、LDH的活性明显降低（p<0.01; p<0.05）;（4）琼脂糖凝胶电泳结果显示JBP485能够抑制Con A直接导致和肝、脾淋巴细胞相互作用而导致的肝细胞DNA的片断化;RT-PCR、细胞免疫化学结果显示,模型I组没有明显的caspase-3表达变化,而模型II组caspase-3表达明显增加,JBP485显著抑制了caspase-3的表达（p<0.05; p<0.05）;（5） RT-PCR、细胞免疫化学结果显示JBP485能够明显抑制细胞因子诱导的ICAM-1的表达（p<0.05; p<0.05）;（6） MTT结果显示JBP485没有明显的抑制淋巴细胞增殖的作用。结论:（1） JBP485对Con A导致的细胞毒有直接的肝细胞保护作用;（2） JBP485能够通过抑制Con A在体外引起的DNA片段化,抑制肝、脾淋巴细胞相互作用引起的肝细胞内caspase-3的表达及其活性的增加而抑制细胞凋亡;（3） JBP485虽然不能直接的抑制淋巴细胞的增殖,即没有明显的免疫抑制作用,但却能够抑制由炎症细胞因子诱导的肝细胞ICAM-1分子的表达从而产生抗炎症作用。（4）通过抑制肝细胞凋亡和下调ICAM-1的表达,推测JBP485可能有助于免疫介导的肝炎的治疗。
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标签：刀豆球蛋白论文; 细胞凋亡论文; 原代培养大鼠肝细胞论文;