河流弧菌对牙鲆粘液的趋化、粘附作用及牙鲆血清抗菌蛋白研究

论文摘要

随着近年来牙鲆（Paralichthys olivaceus）在福建的规模化养殖,由河流弧菌（Vibrio fluvialis）引起的疾病日益严重。病原菌对鱼类粘液的趋化、粘附作用是病原菌的毒力因子之一,了解病原菌对鱼类粘液的趋化、粘附特性不仅有助于了解病原菌的致病机理,对于疾病的防治也有重要的指导意义。鱼类血清中的抗菌蛋白在抗感染免疫中起着重要的作用。本文研究病原性河流弧菌对牙鲆粘液的趋化、粘附作用以及注射河流弧菌后牙鲆血清中的抗菌蛋白,以期进一步了解河流弧菌感染牙鲆的早期阶段的特性以及牙鲆抗感染免疫特性,为养殖牙鲆的河流弧菌病防治提供有价值的参考。本文首先测定了河流弧菌在牙鲆表皮、鳃和肠粘液中的生长情况及其对3种粘液的趋化和粘附作用。试验结果表明:河流弧菌在3种粘液中都能生长,生长前期符合Logistic模型,然后进入Gompertz模型,在鳃粘液中的生长量高于肠粘液和表皮粘液;河流弧菌对牙鲆3种粘液具有较强的趋化应答和粘附作用,在粘液总蛋白含量相同的情况下,河流弧菌对牙鲆鳃粘液的趋化应答显著强于对表皮粘液的趋化应答（P<0.05）,而对肠粘液的趋化应答极显著低于对鳃粘液和表皮粘液的趋化应答（P<0.01）;河流弧菌对牙鲆表皮粘液和鳃粘液的粘附率较高,而对肠粘液的粘附率较低,特别是孵育30、60和90min时河流弧菌对牙鲆表皮粘液和鳃粘液的粘附率显著高于对肠粘液的粘附率（P<0.05）。采用改良的毛细管法研究了细菌浓度、孵育时间、孵育温度、pH值、NaCl浓度、碳水化合物等对河流弧菌趋化作用的影响。试验结果表明:在较低浓度下,河流弧菌对牙鲆表皮粘液的趋化量随着菌浓度的升高而增大;在室温下河流弧菌的趋化量随着孵育时间的延长而增加,60 min趋于饱和;孵育温度在4～15℃范围内趋化作用随温度升高而增强,15℃时达最大值;pH值为8时细菌的趋化性最强;NaCl浓度超过0.8%,河流弧菌的趋化性随着浓度升高而显著减弱（P<0.05）;8种碳水化合物的甘露醇、乳糖、甘露糖能够极显著地促进河流弧菌对牙鲆表皮粘液的趋化作用（P<0.01）。采用3H-TdR同位素示踪方法研究了细菌浓度、孵育时间、孵育温度、pH值、阳离子、碳水化合物等因子对河流弧菌粘附牙鲆表皮粘液的影响。试验结果表明:河流弧菌能很好地粘附于牙鲆表皮粘液,粘附量随菌浓度升高而增大并符合饱和粘附动力学:y=417.89Ln（x）+691.57 （R2=0.986）;在30℃下粘附量随着孵育时间的延长而增加,180min趋于饱和;孵育温度在4～30℃范围内粘附量随温度升高而增多,30℃时粘附量最大;pH值酸性较碱性粘附作用明显,pH值5时最强; NaCl浓度在0.5～4.5%范围内,细菌粘附作用随着浓度升高而增强,较纯水存在显著性差异（P<0.05）;Ca2+、Mg2+能显著加强河流弧菌的粘附作用,但Ca2+作用明显超过Mg2+;葡萄糖等8种碳水化合物对河流弧菌的粘附具有显著的促进作用（P<0.05）。用107cfu·mL-1的河流弧菌菌悬液背部肌肉注射感染牙鲆,注射后1～72h内血清中产生了抗菌物质,且在24h时达高峰值,并与空白对照组存在显著性差异。收集第二次人工注射感染后24h时牙鲆的血清,该血清经Sephadex G-25凝胶柱分离后,在波长280 nm处测定紫外吸收值,得到三个吸收峰。以河流弧菌检测分离物的抗菌活性,结果表明经诱导的血清抗菌物质主要集中在第一个吸收峰。通过对金黄色葡萄球菌等6株指示菌抗菌谱的测定和热稳定性试验,具有抗河流弧菌的分离物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等具有明显的抗菌作用,但在4～125℃温度范围内,随着温度的升高其抗菌活力增强;该分离物经弱阳离子交换柱分离后,在波长280 nm处测定紫外吸收值,得到两个吸收峰,具有抗河流弧菌活性的物质主要集中的第一吸收峰。SDS-PAGE分析显示经Sephadex G-25凝胶柱和弱阳离子交换柱分离的抗菌蛋白分子量较大。这些结果表明,河流弧菌能够在牙鲆粘液,尤其是鳃粘液中生长和定植;牙鲆表皮粘液对河流弧菌有较强的趋化作用和粘附作用,且受环境因子的影响较大;这有利于进一步感染、致病。此外,牙鲆被河流弧菌感染后能很快产生大量抗菌物质释放到血清中;主要的抗菌物质是分子量比较大的物质,且热稳定性较好;这些抗菌物质对部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有抗菌作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献概述
• 1.1 牙鲆
• 1.1.1 牙鲆养殖业的发展
• 1.1.2 牙鲆主要病害
• 1.2 细菌粘附研究进展
• 1.2.1 细菌粘附作用机理
• 1.2.2 细菌体外粘附方法
• 1.2.3 细菌粘附影响因素
• 1.3 细菌趋化
• 1.3.1 趋化的分子机制
• 1.3.2 病原菌的趋化性对水产动物感染致病中的作用
• 1.4 研究内容与技术路线
• 1.4.1 研究内容
• 1.4.2 技术路线
• 第二章 河流弧菌对牙鲆粘液的趋化和粘附作用研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 牙鲆粘液制备
• 2.1.3 河流弧菌在3 种粘液中的生长试验
• 2.1.4 体外趋化试验
• 2.1.5 体外粘附试验
• 2.1.6 数据处理
• 2.2 结果
• 2.2.1 河流弧菌在3 种粘液中的生长情况
• 2.2.2 河流弧菌对3 种粘液的趋化作用
• 2.2.3 河流弧菌对3 种粘液的粘附及孵育时间的影响
• 2.3 讨论
• 第三章 河流弧菌对牙鲆表皮粘液的趋化作用研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 牙鲆表皮粘液制备
• 3.1.3 菌株培养及放射性标记
• 3.1.4 标记菌的放射活性与菌浓度的关系
• 3.1.5 趋化试验
• 3.1.6 菌浓度对河流弧菌趋化作用的影响
• 3.1.7 孵育时间对河流弧菌趋化作用的影响
• 3.1.8 理化因子对河流弧菌趋化的影响
• 3.1.9 数据处理
• 3.2 结果
• 3.2.1 标记菌的放射性与菌量的关系
• 3.2.2 菌浓度对河流弧菌趋化作用的影响
• 3.2.3 不同孵育时间对河流弧菌趋化作用的影响
• 3.2.4 不同理化因子对河流弧菌趋化作用的影响
• 3.3 讨论
• 第四章 河流弧菌对牙鲆表皮粘液粘附作用的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 牙鲆表皮粘液制备
• 4.1.3 菌株培养及放射性标记
• 4.1.4 标记菌的放射活性与菌浓度的关系
• 4.1.5 体外粘附试验
• 4.1.6 菌浓度对河流弧菌粘附的影响
• 4.1.7 孵育时间对河流弧菌粘附的影响
• 4.1.8 理化因子对河流弧菌粘附的影响
• 4.1.9 数据处理
• 4.2 结果
• 4.2.1 标记菌的放射活性与菌数的量化关系
• 4.2.2 菌浓度对河流弧菌粘附的影响
• 4.2.3 孵育时间对细菌粘附的影响
• 4.2.4 不同理化因子对细菌粘附的影响
• 4.3 讨论
• 第五章 河流弧菌感染后牙鲆血清抗菌物质的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料与试剂
• 5.1.2 人工感染后牙鲆血清抗菌活力的变化
• 5.1.3 抗菌物质的诱导与收集
• 5.1.4 抗菌物质的分离及其基本特性的研究
• 5.1.5 抗菌蛋白的电泳
• 5.2 结果
• 5.2.1 河流弧菌感染对牙鲆血清抗菌活性的影响
• 5.2.2 抗菌物质的基础分离
• 5.2.3 抗菌蛋白的电泳
• 5.3 讨论
• 第六章 全文总结和展望
• 6.1 实验结论
• 6.2 创新点
• 6.3 研究计划
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文