人脐带Wharton胶中间充质干细胞生物学特性及组织工程软骨体外构建的实验研究

论文摘要

研究背景:关节软骨损伤是关节外科常见的疾病。软骨由于其自身的解剖特点,损伤后很难自愈,这也是导致关节疾病和关节不稳的主要原因。目前,关节镜下盥洗术、微骨折技术、马赛克移植术等治疗方法远期效果均不满意,最终导致关节软骨的退变和骨性关节炎。采用自体软骨细胞移植（Autologous chondrocyte implantation,ACI）能够实现透明软骨或透明样软骨修复,并取得较好的临床疗效。但ACI的缺点是供区出现新的缺损,需要二次手术,增加患者的痛苦。采用干细胞移植治疗软骨缺损是一个新兴的治疗手段,并认为间充质干细胞（Mesenchvmal stem cells,MSCs）是最有希望的干细胞。MSCs是具有自我复制和多向分化潜能的一类多能干细胞。目前,MSCs主要来源于骨髓,但获得骨髓时造成患者的痛苦,且骨髓源性间充质干细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势,故寻找一种能替代BMSCs,并可弥补其缺陷干细胞来源,已越来越受到各国学者的关注。胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）尚存在定向分化和纯化的技术障碍,且面临众多伦理、法律方面的问题,也有移植后形成畸胎瘤的报道,应用受到一定限制。脐带属于胚胎外组织,是胎儿分娩后的废弃物,组织来源广泛,无伦理学限制。脐带由脐带外膜、脐动脉、脐静脉以及血管周围的黏蛋白样组织,后者被称为Wharton胶。本研究目的为探讨脐带Wharton胶中干细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性,并从四个方面进行阐述。第一部分为人脐带Wharton胶中的基质成分定性和定量分析的实验研究;第二部分为人脐带脐带Wharton胶中MSCs的分离、培养及生物学性状的实验研究;第三部分人脐带Wharton胶中MSCs向软骨诱导培养的实验研究;第四部分为细胞因子在人脐带Wharton胶间质干细胞及其诱导产生的软骨细胞的表达。本研究从组织学、细胞学和组织化学、基因水平和蛋白表达水平探讨脐带Wharton胶及Wharton胶中MSCs的生物学特性和向软骨诱导的可行性。方法:（1）对脐带组织进行组织化学和免疫组织化学染色,同时对Wharon胶进行葡萄糖胺聚糖（Glycosaminoglycans,GAGs）和总胶原含量的测定。（2）从手术台取足月正常产健康产妇脐带组织,去除脐血管和外膜组织,剥离Wharton胶,采用胶原酶消化法和小组织块两种培养方法进行原代培养;对不同代的脐带MSCs进行生长曲线、表面标志、流式细胞检测表面标志、成纤维细胞集落生成单位（Colony-forming unit-fibroblast,CFU-F）、生长周期、冻存与复苏及逆转录PCR（Reverse transcription-polymerase chain raction,RT-PCR）分析,并进行番红“O”染色、甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组化染色进行软骨特异性标志的鉴定。（3）在DMEM中加入10%FBS,10ng/mLTGF-β1,25ng/mL bFGF,10-7M地塞米松作为诱导培养基。采用普通诱导培养、密集诱导培养、结合生物反应器技术体外构建无支架软骨组织。成软骨细胞表型通过番红“O”染色、甲苯胺兰染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行鉴别。GAGs定量检测应用二甲基亚甲兰法,Ⅱ型胶原定量检测通过ELISA法。（4）分别对人脐带Wharton胶MSCs、向软骨诱导培养后的MSCs以及人软骨细胞进行细胞因子抗体芯片检测,比较人脐带Wharton胶MSCs软骨诱导前后与正常人软骨细胞细胞因子表达水平,为同种异体移植奠定实验基础。结果:（1）人脐带组织富含胶原和GAGs,HE染色发现Wharton胶中含有大量的间质细胞;（2）采用酶消化法分离可以快速分离Wharton胶中间质细胞,并迅速贴壁生长;采用组织块法培养原代培养时间较长。流式细胞检测表明这些细胞表达CD44、CD105、CD271等MSCs标志物;不表达CD34、CD45等造血等标志物;HLA-ABC阳性表达,HLA-DPDQDR阴性表达。经过冻存复苏后免疫表型无显著变化。（3）未进行软骨诱导的细胞弱表达软骨细胞标志,诱导后GAGs和Ⅱ型胶原定量检测结果均显著高于未诱导细胞。RT-PCR结果显示人脐带Wharton胶MSCs诱导前后均表达Sox-9、Col-2a1。人脐带Wharton胶MSCs经密集诱导培养后迅速结成膜状;采用密集诱导培养结合生物反应器培养体外可以构建大块无支架组织工程软骨。（4）采用细胞因子芯片技术对人脐带Wharton胶MSCs、诱导后的软骨细胞以及正常软骨细胞进行比较分析发现,脐带Wharton胶干细胞以及诱导后的软骨细胞在软骨相关因子表达水平与软骨细胞接近;同时还表达肿瘤抑制生长因子以及某些神经生长因子。结论:（1）人脐带Wharton胶富含胶原和GAGs,具有与软骨组织相似的细胞外基质;（2）人脐带Wharton胶中MSCs来源广泛,无伦理学限制;脐带MSCs具有间质干细胞的特性,不向造血系分化;（3）脐带MSCs具有前软骨细胞的特性,有望作为软骨组织工程的新型的种子细胞。脐带MSCs密集诱导培养结合旋转式细胞培养系统可体外构建大块无支架组织工程软骨组织,有望作为新型体外构建软骨组织的方法。（4）人脐带Wharton胶MSCs以及诱导后的软骨细胞具有与软骨细胞相同的表达谱,表明其更为接近软骨细胞,是较好的软骨组织工程的种子细胞来源。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 人脐带组织基质成分定性与定量分析的实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 人脐带Wharton胶中间充质干细胞分离、培养及生物学特点的实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 人脐带Wharton胶中间充质干细胞向软骨诱导培养的实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 细胞因子在人脐带Wharton胶间质干细胞及其诱导产生的软骨细胞的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 总结
• 参考文献
• 文献综述
• 新型种子细胞—脐带间充质干细胞在组织工程中的应用
• 参考文献
• 缩略词表
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢