乳酸菌复合发酵对共轭亚油酸生物合成的影响

论文摘要

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid, CLA）是亚油酸的同分异构体。作为一种新型功能性油脂,它在癌症、动脉硬化、肥胖症和免疫功能领域上对健康潜在的益处引起了人们的关注。目前,共轭亚油酸的生产主要采用化学合成,由于存在不安全因素,人们越来越关注生物合成方面。因此,生物合成的共轭亚油酸具有广泛的商业前景。细胞固定化技术是20世纪70年代兴起的一种生物技术。固定化细胞应用于食品工业的主要优点在于能保护细胞不受外界不利条件如酸、碱、有害离子等的影响,并且能起到连续生产的目的。本文选用嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus, La）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus, St）作为实验菌种进行混合发酵。采用紫外分光光度（UV）法对CLA进行定量分析。通过紫外诱变,硫酸二乙酯诱变选育到两株将LA转化为CLA能力较高的菌株,并优化了混菌发酵条件和固定化条件,使CLA产量进一步提高,从而达到连续生产和提高乳品功能性的目的。嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌原始菌株混菌发酵产CLA的最佳发酵条件为：接种量4%、菌种比例（La:St=1:1）、底物添加量4%、培养温度40℃、pH5.5、培养时间60h,在此发酵条件下CLA合成量可达151.88μg/mL。将嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌分别进行紫外诱变和硫酸二乙酯诱变处理,获得高合成CLA的突变株La-1和St-1,其中La-1的CLA产量达到62.71μg/mL,较原始菌株提高了75.71%；St-1的CLA产量达到80.41μg/mL,较原始菌株提高了105.39%。通过响应曲面法对突变株La-1和St-1进行混菌发酵,产CLA的最佳发酵条件为：温度43℃、底物添加量5%、接种量4%（La:St=1:1）、初始pH6.5,在此条件下培养48h后CLA合成量可达220.63μg/mL,比原始菌株混菌发酵的产量提高了45.27%。突变株La-1和St-1的最佳固定化条件为：氯化钙3%、海藻酸钠4%、菌体包埋量60%、胶粒直径3mm、固定化时间1h；最佳混菌发酵条件：培养温度40℃、培养时间36h,在此发酵条件下CLA合成量可达291.70μg/mL。比突变游离菌株的产量提高了32.21%,比原始游离菌株的产量提高了92.06%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 共轭亚油酸的结构及特点
• 1.1.1 共轭亚油酸的的发现
• 1.1.2 共轭亚油酸的结构及特点
• 1.2 共轭亚油酸的来源
• 1.2.1 天然来源
• 1.2.2 人工合成
• 1.2.2.1 化学合成法
• 1.2.2.2 生物合成法
• 1.3 共轭亚油酸的生理功能
• 1.3.1 共轭亚油酸的抗癌作用
• 1.3.2 共轭亚油酸的降脂作用
• 1.3.3 共轭亚油酸防止动脉粥样硬化作用
• 1.3.4 共轭亚油酸的免疫作用
• 1.3.5 共轭亚油酸的抗氧化作用
• 1.3.6 其他方面的功能
• 1.4 共轭亚油酸的分析检测方法
• 1.4.1 紫外（UV）分光光度法
• 1.4.2 气相-傅里叶变换红外光谱联同法（GC-FTIR）
• 1.4.3 气相色谱法（GC）
• 1.4.4 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.4.5 气-质联用（GC-MS）
• 1.4.6 核磁共振法
• 1.5 混菌发酵法
• 1.5.1 联合发酵
• 1.5.2 顺序发酵
• 1.5.3 共固定化细胞混菌发酵
• 1.5.4 混合固定化细胞混菌发酵
• 1.5.5 嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌互生机理
• 1.6 微生物诱变育种研究
• 1.6.1 诱变方法
• 1.6.2 诱变机理
• 1.6.3 产CLA乳酸菌的诱变
• 1.7 固定化细胞的研究现状
• 1.7.1 吸附法
• 1.7.2 包埋法
• 1.7.2.1 海藻酸钠包埋法
• 1.7.2.2 聚丙烯酰胺凝胶包埋法
• 1.7.2.3 卡拉胶包埋法
• 1.7.2.4 明胶包埋法
• 1.7.2.5 聚乙烯醇包埋法
• 1.7.3 共价结合法
• 1.7.4 交联法
• 1.8 共轭亚油酸的发展前景
• 1.8.1 CLA添加物的安全性
• 1.8.2 CLA在食品工业中的应用
• 1.8.2.1 CLA作为保健食品
• 1.8.2.2 CLA作为新型的食品防腐剂
• 1.8.2.3 CLA作为新型的食品添加剂
• 1.8.2.4 强化CLA的乳酸菌发酵乳制品
• 1.9 本论文的主要研究内容及意义
• 1.9.1 研究内容
• 1.9.2 研究意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验试剂
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.2 菌种
• 2.3 培养基
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 CLA紫外光谱定量分析检测方法
• 2.4.2 滴定酸度的测定
• 2.4.3 红花油水解液乳化液的制备
• 2.4.3.1 花油的水解方法
• 2.4.3.2 花油水解乳化液的制备
• 2.4.4 混菌和单菌发酵比较
• 2.4.5 原始菌株复合发酵条件的优化
• 2.4.5.1 菌株生长曲线的制备
• 2.4.5.2 单因素发酵条件的确定
• 2.4.5.3 正交试验
• 2.4.6 高产CLA菌株的诱变选育
• 2.4.6.1 供试菌体的培养
• 2.4.6.2 紫外诱变
• 2.4.6.3 硫酸二乙酯诱变
• 2.4.6.4 诱变菌株的稳定性研究
• 2.4.7 诱变菌株复合发酵条件的优化
• 2.4.7.1 诱变菌株生长曲线的绘制
• 2.4.7.2 诱变菌株单因素发酵条件的确定
• 2.4.7.3 响应曲面法优化诱变菌株最佳混菌发酵条件
• 2.4.8 诱变菌株固定化条件的优化
• 2.4.8.1 诱变菌株固定化条件单因素的确定
• 2.4.8.2 正交试验
• 2.4.8.3 发酵条件对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 2.4.8.4 固定化菌株的重复发酵
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 混菌与单菌发酵比较结果
• 3.2 原始菌株发酵条件的优化
• 3.2.1 菌株生长曲线的绘制
• 3.2.2 单因素发酵条件优化
• 3.2.2.1 培养温度对共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.2.2.2 底物添加量对共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.2.2.3 菌种比例对共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.2.2.4 培养基初始pH对共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.2.2.5 培养时间对共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.2.2.6 接种量对共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.2.3 正交试验
• 3.2.4 验证试验
• 3.3 高产CLA菌株的诱变选育
• 3.3.1 紫外处理菌体致死率曲线
• 3.3.2 硫酸二乙酯（DES）处理菌体致死率曲线
• 3.3.3 诱变菌株产CLA稳定性的研究
• 3.4 高产CLA诱变菌株发酵条件的优化
• 3.4.1 La-1和St-1生长曲线的绘制
• 3.4.2 单因素发酵条件优化
• 3.4.2.1 培养时间对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.4.2.2 接种量对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.4.2.3 底物添加量对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.4.2.4 培养基初始pH对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.4.2.5 培养温度对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.4.3 响应曲面法优化诱变菌株最佳混菌发酵条件
• 3.4.3.1 响应面分析因素及水平的确定
• 3.4.3.2 模型的建立及其显著性检验
• 3.4.3.3 响应曲面分析与优化
• 3.5 诱变菌株固定化条件的优化
• 3.5.1 诱变菌株固定化条件单因素的确定
• 3.5.1.1 氯化钙浓度对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.5.1.2 海藻酸钠浓度对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.5.1.3 菌体包埋量对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.5.1.4 胶粒直径对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.5.1.5 固定化时间对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.5.2 正交试验
• 3.5.3 验证试验
• 3.5.4 发酵条件对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.5.4.1 培养温度对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.5.4.2 培养时间对菌体生长及共轭亚油酸生物合成的影响
• 3.5.5 固定化菌株的重复发酵
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A CLA的紫外波长扫描
• 附录B CLA标准曲线的制作