论文摘要
目前已知的各种维A酸（RA）衍生物达2500余种之多,广泛用于150种疾病的治疗,特别是在治疗难治性角化性皮肤病方面,例如银屑病,为临床医师提供新的治疗手段,而且其治疗作用和适应症仍在不断认识和扩展之中。RA疗法被认为是皮肤科药物治疗史上的“第二次革命”。RA的基本结构包括环己烯、侧链和极性基团三个部分组成,并据此分为三代,即非芳香类、单芳香类和多芳香类。第一代RA为天然存在的,包括全反式维A酸（atRA）、9-顺式维A酸和异维A酸。第二代RA由人工合成,如依曲替酯及依曲替酸。第三代RA的显著特点是引入了多芳香环状结构,具有受体选择性,提高了药物作用的针对性,同时减少了不良反应,如阿达帕林、他扎罗汀。芳维A酸氨丁三醇具有多芳香环状结构,属于第三代维A酸。银屑病特征性的病理变化是表皮细胞过度增殖和分化异常,同时伴随显著的炎症反应。随着银屑病发病机制研究的深入,现多认为银屑病是在多基因遗传背景下的免疫异常性疾病,异常活化的T淋巴细胞及其分泌的多种细胞因子是发病的中心环节。RA在银屑病治疗过程中取得良好疗效,但是其具体作用机制尚不清楚。研究表明其具有抗角质形成细胞增生及抗肿瘤作用。近年来关于其免疫调节作用的研究越来越受到关注,认为RA药物可以从许多方面影响机体免疫系统功能,如免疫细胞的增殖分化、免疫活性信号的传导、细胞因子的产生,从而影响细胞免疫功能和免疫球蛋白的产生,某些方面还对表现出双向调节作用,然而,支持“RA具有调节免疫的作用”的研究资料的数量非常有限,而关于RA对正常机体免疫系统以及银屑病时的机体免疫系统影响尚缺乏系统研究,相信,随着研究的深入,这方面的研究将成为一个新的热点。关于第一代RA全反式维A酸（atRA）与9-顺式维A酸,它们可以影响正常人外周血T淋巴细胞增殖,研究结果证实:RA作用于健康人外周血T淋巴细胞是一个复杂的过程,作用机制是多样性的。JAK（Janus激酶）/STAT（信号转导子和转录激活子）信号途径是与细胞生长、增殖和分化关系十分密切的一条信号通路,是细胞因子信号传递的主导作用,也是淋巴细胞活化的重要途径之一。细胞因子在免疫细胞的生长、分化以及免疫调节中具有十分重要的作用,故JAK/STAT途径与免疫系统之间的关系已逐渐成为人们研究的一个新热点,对具体的信号转递过程及调控环节的详尽研究,将有助于我们深入理解细胞间相互作用以及人体中正常的生理过程和某些疾病的发生机制,并可能为药物的药理学作用提供理论基础。Choi等用RA处理的大鼠脑部的星形胶质细胞,发现全反式和9-顺式维甲酸,通过抑制JAK/STAT途径的活化,进而抑制INF-γ诱导的炎症反应。JAK是蛋白酪氨酸激酶（PTK）,迄今为止发现4种家族成员:JAK1,JAK2,JAK3,和TYK2。其中JAK3在活化的T细胞、B细胞和单核细胞中有广泛的表达。JAK3可以被IL-2、IL-4、IL-7激活,在某些情况下,JAK也可以被表皮生长因子受体（EGFR）、血小板衍生生长因子受体（PDGFR）等生长因子受体所活化。GU等人发现类风湿关节炎、关节病型银屑病的病人的外周血混合淋巴细胞中JAK3高表达。最近发现JAK/STAT途径的激活,特别是STAT的激活,对于细胞的生长、增殖和转化产生重要影响。研究表明,正常情况下,STAT5对维持细胞的正常功能、调节细胞的增殖与分化具有重要作用。当STAT5不适当活化时,通过引起下游靶基因如cyclinD1、c-myc和bcl-xL过度表达诱导细胞癌变并阻断细胞凋亡。STAT5的过度表达可能在各种癌症发生发展过程中起重要作用,STAT5在介导免疫耐受过程起重要作用,STAT5缺陷鼠表现为轻度的淋巴细胞减少和外周血T细胞增殖的缺陷。受体选择性RA的出现大大减少了RA衍生物在使用时的副作用,从而鼓励了人们在RA类药物构型及结构上的研究。芳维A酸氨丁三醇是在RAR选择性激动剂芳香维A酸的基础上加上氨丁三醇基团合成的第三代RA,它增加了芳香维A酸的分子量和可溶度。本课题主要比较研究了芳维A酸氨丁三醇和第二代RA依曲替酸对银屑病患者外周血T淋巴细胞增殖的剂量效应及其与JAK3、STAT5转录及蛋白水平的相关性,研究药物是否作用银屑病患者外周血JAK/STAT信号转导途径有助于从一个新的角度探索药理机制,从而为治疗银屑病提供新的作用靶点。第一部分芳维A酸氨丁三醇及依曲替酸对银屑病患者外周血T淋巴细胞增殖的剂量效应目的:研究第三代RA（芳维A酸氨丁三醇）和第二代RA（依曲替酸）对银屑病患者T淋巴细胞增殖的剂量效应。方法:抽取银屑病人外周血,分离T淋巴细胞,经不同浓度药物处理后,台盼蓝染色检测细胞活力,用改良MTT法检测淋巴细胞增殖变化。结果:0.1μM的两种药物处理后,活细胞比例低（未选用该浓度）,10-9-10-6mol/L浓度范围内,两种药物均对银屑病人外周血T淋巴细胞的增殖有抑制作用,与空白对照组相比有显著统计学意义,且两种药物之间比较有统计学意义。结论:芳维A酸氨丁三醇和依曲替酸可明显抑制银屑病患者外周血T淋巴细胞的增殖,且呈剂量依赖性,芳维A酸氨丁三醇比依曲替酸抑制作用更明显。第二部分芳维A酸氨丁三醇及依曲替酸对JAK3基因表达的影响目的:研究芳维A酸氨丁三醇及依曲替酸对银屑病患者T淋巴细胞表达的JAK3转录水平的变化。方法:细胞按照5×105接种于培养瓶中,分别加入10-9～10-5 mol/L芳维A酸氨丁三醇、依曲替酸,对照孔不加药, 37℃培养48h后,提取总RNA,以GAPDH/β-actin为内参照,用Real-time PCR方法检测JAK3mRNA表达变化。结果:不同浓度的芳维A酸氨丁三醇和依曲替酸处理48h后,JAK3在转录水平的表达相比其基础表达有统计学意义。结论:两种药物均可下调银屑病患者T淋巴细胞JAK3mRNA的表达,且芳维A酸氨丁三醇的下调作用更显著。第三部分芳维A酸氨丁三醇及依曲替酸对JAK3、STAT5蛋白表达的影响目的:研究芳维A酸氨丁三醇和依曲替酸对JAK3及其下游蛋白STAT5蛋白表达的影响。方法:将上述经药物处理后的细胞,配成5×106个/mL细胞悬液。经RIPA裂解液裂解蛋白, Western印迹法检测JAK3、STAT5蛋白的表达。结果:芳维A酸氨丁三醇和依曲替酸处理细胞48小时后提取JAK3蛋白表达相比基础水平有显著下调;其下游蛋白STAT5表达相比其基础表达无统计学意义上的差别结论:芳维A酸氨丁三醇及依曲替酸明显下调JAK3蛋白表达,其下游STAT5蛋白表达无明显改变。