论文摘要
【鼻咽癌与c-myc的研究背景】鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一种多基因遗传性恶性肿瘤，其病因主要涉及遗传易感性、基因组不稳定性、多种癌基因与抑癌基因结构和功能的改变及EB病毒感染、化学致癌物作用。然而，鼻咽癌发病的分子机制尚不清楚。原癌基因c-myc位于8号染色体的8q24区，是一个高度保守的细胞癌基因。近年来已有众多研究发现c-myc癌基因的异常激活、过度表达与鼻咽癌的发生发展及预后存在着密切关系。Western blot检测也证实5-8F、6-10B、HNE1、CNE1等鼻咽癌细胞株中均存在内源性c-myc的高表达。【封闭c-myc的真核表达载体的构建、鉴定及稳定干扰细胞系的建立】为了探讨c-myc基因高表达与鼻咽癌发生发展的关系，本文通过siRNA design tool软件优化设计Ⅰ和Ⅱ两条靶向序列，分别针对c-mycORF的1357bp-1377bp和1716bp-1738bp。通过重组体技术构建c-myc基因的siRNA真核表达载体pRNAT-U6.1／siRNA-c-myc，运用转基因技术，将其导入c-myc基因高表达的鼻咽癌细胞株5-8F中，经G418筛选，建立沉默c-myc基因的稳定转染细胞系，即5-8F／siRNA-c-myc细胞系，并以pRNAT-U6.1空载体转染5-8F细胞为对照，即5.8F／siRNA-Control细胞系。通过RT-PCR和Western blot鉴定c-myc基因的封闭效果，结果发现与对照组相比，Ⅰ能有效抑制c-myc的高表达，效果达70％-75％；Ⅱ的效果不明显。因此我们选择抑制效果最佳的5-8F／siRNA-c-mycⅠ／C3阳性单克隆细胞系进行后续实验。【抑制c-myc基因高表达对5-8F细胞超微结构的改变】将5-8F、5-8F／siRNA-Control和5-8F／siRNA-c-mycⅠ／C3进行透射电镜扫描，结果显示：抑制c-myc表达的5-8F细胞表面微绒毛逐渐脱落，稀少；部分细胞结构趋于正常化，胞浆内线粒体数量中等，结构较清晰，少量内质网；部分细胞趋于静止状态，胞浆内线粒体嵴丢失或呈空泡变，内质网轻度扩张。空白对照及未处理5-8F细胞表面微绒毛较丰富，胞浆内线粒体数量较多，结构较清晰，核浆比例严重失调。表明封闭c-myc的高表达有利于细胞间的紧密接触，增强接触抑制，不利于细胞的快速生长，从而逆转5-8F细胞的恶性生物学行为。【抑制c-myc高表达对5-8F细胞生长的影响】将5-8F、5-8F／siRNA-Control和5-8F／siRNA-c-mycⅠ／C3细胞分别接种200个到平板中，静止培养14天左右直至肉眼可见克隆形成，终止培养，观察每组细胞的克隆形成数并计算克隆形成率；分别取0.5×104个细胞接种于96孔板，每种细胞接种8孔，连续6天在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值，进行MTT检测；分别取1×104个细胞接种于24孔板，每种细胞接种3孔，连续7天同一时间胰酶消化各组细胞，检测细胞生长曲线。结果发现：与5-8F／siRNA-Control细胞相比，5-8F／siRNA-c-mycⅠ／C3细胞克隆生长速度较慢，形成的克隆较小，平均克隆形成率明显降低；细胞活力和细胞生长速度也受到抑制。分别以1×107细胞接种裸鼠，30天左右颈椎脱臼处死并分离肿瘤块。发现5-8F／siRNA-c-mycⅠ／C3组肿瘤重量明显小于5-8F／siRNA-Control组，将干扰组和空白对照组肿瘤块进行病理切片，结果表明均为低分化鳞癌，无组间差异，说明干扰内源性c-myc高表达对裸鼠移植瘤生长具有抑制作用，但对肿瘤分化程度没有明显影响。运用流式细胞术分析5-8F、5-8F／siRNA-Control和5-SF／siRNA-c-mycⅠ／C3对5-8F细胞周期和细胞凋亡的影响。结果显示：抑制c-myc基因高表达可导致G0／G1期细胞增多（66.2％），较5-8F（47.8％）和空载体转染的5-8F（46.9％）明显增加，S期和G2／M期细胞减少，而对细胞凋亡没有明显影响。【抑制c-myc高表达可下调Rb／E2F信号转导通路重要分子的表达】为了寻找封闭c-myc高表达抑制鼻咽癌细胞G1-S进程的分子机制，运用Western blot技术检测Rb／E2F通路中的相关分子，结果发现：CDK2、CDK4、cyclinD1、pRb、E2F3、DP2在5-8F／siRNA-c-mycⅠ／C3中的表达较5-8F和5-8F／siRNA-Control明显下调，说明c-myc基因的生物学功能与Rb／E2F分子通路有关。综上所述，本研究通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）封闭内源性c-myc的高表达，可改变5-8F细胞的超微结构，抑制5-8F细胞生长和移植瘤生长，增加G0／G1期细胞，减少S期细胞，下调Rb／E2F信号通路重要分子的蛋白表达水平。因此，c-myc作为一细胞癌基因，其作用机理可能是通过激活Rb／E2F信号转导通路加速G1-S细胞周期进程，促使细胞生长增殖，从而参与鼻咽癌的发生发展。本研究不仅为鼻咽癌分子机制的阐明提供了新的研究线索，从RNAi的角度为基因功能研究提供了一个快速有效的系统，而且为鼻咽癌的基因治疗提供了理论基础，可望c-myc能够成为人类鼻咽癌的一个治疗靶标。