论文摘要
本论文以脱氧胆酸为疏水基团,制备了疏水修饰的透明质酸-脱氧胆酸耦合物,研究了这种两亲性分子在水溶液中的自组装行为;以阿霉素为模型药物制备了载药的透明质酸纳米粒,研究了其在体外的药物缓释效果;以人宫颈癌上皮细胞系（human epithelioid cervical cancer cell line, HeLa）细胞为模型细胞,考察了载药纳米粒的体外肿瘤细胞杀伤率,并探讨了细胞对纳米粒的吞噬机制。利用EDC作为交联剂,通过酰胺键共价连接脱氧胆酸（doxycholic acid, DOCA）到透明质酸（hyaluronic acid, HA）上制备HA-DOCA（HD）化学耦合物,并改变脱氧胆酸与透明质酸的反应摩尔比制成三种不同取代度的样品（HD6、HD7、HD9）。利用核磁共振检测证明了产物的结构;利用微量滴定法测定了产物的取代度,每个HA链约含有5.9-9.4个DOCA分子。通过超声法制备HD纳米粒悬液,利用荧光探针检测了纳米粒的自聚集性质,发现HD纳米粒的临界聚集浓度（CAC）随着取代度的增加而降低,三种样品的CAC值分别是:0.056mg/ml、0.037mg/ml、0.025mg/ml;纳米粒内核的疏水性随取代度的增加而提高;利用荧光淬灭技术研究了纳米粒内部疏水簇的交联数量和其显微结构,疏水微区的浓度（NDOCA）和聚合物链的聚集数量（Nchain）随着脱氧胆酸取代度的增加而增加,表明HD纳米粒内部形成了多个疏水的内核;利用动态激光散射与透射电子显微镜技术对纳米粒的形态进行了表征,纳米粒的大小随取代度增加而减小,三种样品的平均粒径分别是:1144nm,447nm,208nm,纳米粒近似球形,形态完整。利用疏水相互作用,把模型药物-阿霉素装载进入纳米粒的疏水内核中,制备载药纳米粒。通过改变药物与纳米粒的重量比,制备不同载药量的样品,然后在确定重量比的情况下,制备不同取代度的载药纳米粒,并研究了这些样品在体外的药物释放情况。结果表明,加药量越高纳米粒载药量越大,HD6纳米粒的最高载药量可达11.58%,载药率则随着载药量的增加而降低;取代度越高,载药量越大,载药率越高;三种取代度的纳米粒均有较好的药物缓释效果,缓释时间可达5天以上,体外药物释放呈三段模式,先是初期的突释,接着是一接近匀速的释放,最后是缓慢和持续的长时间释放,载药量和取代度均对药物释放有较大的影响,载药量越大、取代度越高药物与纳米粒内核的结合越紧密,部分药物在纳米粒中结晶化,使得药物释放的突释量降低、缓释效果增强。本文还用MTT比色的方法研究了HD纳米粒的细胞毒性和不同取代度的载阿霉素HD纳米粒的对肿瘤细胞杀伤的有效性,并利用荧光酶标仪与荧光显微镜检测了细胞对于荧光标记的HD纳米粒的吞噬情况。结果表明,空白HD纳米粒对HeLa细胞无显著毒性,孵育3天存活率仍在95%以上;不同取代度载药纳米粒均显示了肿瘤细胞生长抑止作用,随取代度升高对癌细胞的杀伤率增加,载药纳米粒细胞毒性体现出浓度与时间的依赖性,药物浓度为10μg/ml时,孵育3天内三种载药纳米粒的细胞杀伤率分别达到:33.72%, 41.27%, 49.76%,与阿霉素注射剂相比,在1-5μg/ml时HD9载药纳米粒显示出更高的细胞毒性,在10μg/ml时亦表现出与其相当的抗肿瘤细胞活性;HeLa细胞对HD纳米粒的吞噬依赖于纳米粒的浓度与孵育的时间,4个小时内细胞对纳米粒的吞噬呈线性增长,浓度越低细胞的吞噬率越高,最高吞噬率达50%以上;取代度是影响细胞对纳米粒吞噬的另一关键因素,相同条件下,取代度越高细胞对纳米粒的吞噬速度越快,效率越高,孵育时间内有一半以上的HD9纳米粒被吞噬到细胞中;荧光显微镜观测可直观的看到纳米粒与细胞特异结合到被吞噬到胞质内的过程,显示出很强的时间依赖性,与荧光酶标仪的测定结果一致。