硅、硫对水稻砷吸收、积累的影响机制研究

论文摘要

随着工业技术的不断发展,重金属污染所造成的社会问题和环境问题越来越受到人们的广泛关注。砷作为一种致癌的微量元素,广泛存在于环境中。砷污染的灌溉水、土壤由植物吸收富集后,可通过食物链进入人体,从而给人们的健康造成伤害。目前我国已经成为世界卫生组织（WHO）列出的砷污染最严重的国家和地区之一,因此,研究一种行之有效的方法用以降低砷经食物链给人体健康所带来的风险迫在眉睫。水稻作为我国三大主要粮食作物之一,对其砷污染的控制也是十分重要的关乎人体健康的问题。水稻是典型的喜硅作物,施硅能够促进水稻的生长和高产、稳产,也有研究报道硅能够显著降低水稻植株对As（V）和As（III）的吸收,那么硅影响水稻砷吸收的内在机理是什么?目前还没有清楚、完整的解释。另一方面,重金属胁迫条件下,植物螯合肽（PCs）的合成是植物对胁迫的一种适应性反应,且PCs是植物体内主要的解毒物质。硫作为水稻植株蛋白质的重要组成成分,其对植物螯合肽（PCs）的合成非常重要。那么硫对水稻砷吸收、积累的影响程度如何及其机理是什么?目前国内外这方面的研究还不多,这也是本论文的主要研究问题。采用室内水培和大田盆栽的方法研究了高效吸硅基因型TN1、白香粳和低效吸硅基因型卷叶粳和一目惚在硅、砷处理条件下对砷吸收、转运和积累的差异及相关的生理生化机制;通过不同浓度的硫处理研究了施加硫对水稻砷胁迫下植株抗氧化系统、植物螯合肽合成及砷转运积累等方面的影响,同时结合分子生物学技术克隆得到一条植物螯合肽合成酶（PCS）基因,为下一步开展PCS基因功能的研究奠定了基础。本论文主要研究结果如下:（1）硅对水稻砷吸收、转运和积累的影响机制研究通过室内水培和大田盆栽试验,对不同吸硅速率水稻基因型苗期和成熟期水稻植株对砷的吸收、转运和积累及相关的生理指标研究发现,不同基因型水稻对砷的吸收和转运存在差异。水稻苗期低效吸硅基因型在低砷条件下根部向地上部转运砷的能力比高效吸硅品种强,并且其根部ATPase活性、非蛋白类巯基（NPT）含量的变化均比高效吸硅基因型的大;而在加砷条件下高效吸硅品种根部与地上部积累的砷受硅素影响更大,但硅素对根表铁膜的数量影响并不显著。硅素的施用能够降低水稻籽粒、稻壳、茎部、叶部和根部中砷的浓度,且稻壳的砷浓度在基因型间存在显著差异。（2）硫对水稻砷吸收、转运和积累的影响机制研究硫是含巯基类多肽的主要组成成分,故对植物螯合肽（PCs）和GSH的合成非常重要。通过不同浓度的砷酸盐胁迫研究发现,低浓度砷条件下水稻幼苗施硫能够促进砷向地上部转运;高浓度砷条件下施硫能够显著降低水稻植株中的砷浓度。并且,施硫处理还显著增加了水稻植株根部NPT、GSH、PCs的含量,说明在高浓度砷胁迫条件下,硫能够通过增加水稻植株中植物螯合肽的含量来提高水稻对重金属的抗性。进一步的试验表明,水稻幼苗经低硫(1.8μM SO42-)或高硫(0.7 mM SO42-)预处理1214d及在10μM的亚砷酸盐或砷酸盐胁迫下生长2天或1天后,除了低硫预处理后砷酸盐处理的水稻根部主要形态是砷酸盐外,其它处理后水稻植株中砷的形态均为亚砷酸盐。在亚砷酸盐处理中,并且低硫预处理的水稻根系中亚砷酸盐积累量低于高硫预处理,但低硫预处理的水稻地上部中亚砷酸盐浓度显著高于高硫预处理的水稻地上部。在砷酸盐处理中,低硫预处理使根系砷积累显著降低。与高硫处理相比,低硫预处理植株的砷转运系数较高。除此之外,营养液中硫素不足使砷胁迫下水稻根系中非蛋白巯基的浓度降低。这些结果说明水稻根系积累的砷大都以亚砷酸盐的形态存在,且硫素状况直接影响到砷从根系向地上部的转运,这可能与亚砷酸盐和植物螯合肽形成络合物有关。（3）水稻植物螯合肽合成酶（PCS）基因的克隆及植物表达载体的构建利用RT-PCR方法从水稻总RNA中经反转录克隆出植物螯合肽合成酶（phytochelatin synthase,PCS）基因。通过序列分析发现该基因是位于水稻的第6号染色体上,并且与已经登陆的水稻（Oryza sativa）NM001063069.1核苷酸序列同源性最高,而与高粱、玉米的亲缘关系较远。同时,为进一步研究PCS的理化性质及生物功能,利用pET-28a、pCam2335分别构建了该基因的原核表达载体和非特异性表达载体。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 砷的文献综述
• 1.1.1 环境中砷的分布及存在形态
• 1.1.2 植物组织中的砷及形态
• 1.1.3 植物对砷的吸收、转运和积累
• 1.1.4 砷的毒害及解毒机制
• 1.2 硅素概述
• 1.2.1 植物体内的硅及分布
• 1.2.2 水稻对硅的吸收和转运
• 1.2.3 硅对植物的生理作用
• 1.2.4 硅、砷的研究意义
• 1.3 硫的概述
• 1.3.1 硫在环境和植物中的分布
• 1.3.2 植物对硫的吸收和利用
• 1.3.3 硫对植物的生理作用
• 1.3.4 硫、砷的研究意义
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 试验概况
• 3.2 试验设计
• 3.2.1 硅砷试验设计
• 3.2.2 硫砷试验设计
• 3.3 测定指标及方法
• 3.3.1 水稻幼苗根部 ATPase 活性
• 3.3.2 水稻新鲜根系上的铁膜的测定方法
• 3.3.3 植株各组织器官中 As 形态、浓度及磷含量的测定
• 3.3.4 抗氧化酶系统（SOD、POD、MDA）酶活性的测定
• 3.3.5 可溶性蛋白的含量
• 3.3.6 非蛋白巯基（NPT）的含量
• 3.3.7 土壤中As 含量的测定
• 3.3.8 水稻根部谷胱甘肽（GSH）的含量
• 3.4 目的基因的克隆
• 3.4.1 水稻总RNA 的提取和质量鉴定
• 3.4.2 水稻鲜样总RNA 的提取（Trizol 法）
• 3.4.3 目的基因的克隆
• 3.4.4 重组质粒的构建及鉴定
• 3.4.5 植物表达载体的构建和鉴定
• 3.5 数据分析
• 3.6 统计分析
• 4 结果与分析
• 4.1 硅素对不同吸硅速率基因型水稻砷的吸收、积累的影响
• 4.1.1 硅素对不同吸硅速率基因型水稻幼苗根部ATPase 活性的影响
• 4.1.2 硅素对不同吸硅速率基因型水稻幼苗根系非蛋白类巯基（NPT）含量的影响
• 4.1.3 硅素对不同吸硅速率基因型水稻幼苗砷积累量的影响
• 4.1.4 硅素对不同吸硅速率基因型水稻苗期地上部和根部干物质重的影响
• 4.1.5 硅素对不同吸硅速率基因型水稻苗期根表铁膜数量的影响
• 4.1.6 硅素对不同吸硅速率基因型水稻苗期地上部和根部砷积累量的影响
• 4.2 硅素对不同吸硅速率基因型水稻成熟期砷吸收和积累的影响
• 4.2.1 硅素对不同吸硅速率基因型水稻成熟期各组织器官中砷积累量的影响
• 4.3 硫素对水稻砷吸收、积累的影响
• 4.3.1 硫素对不同砷浓度条件下水稻幼苗根部NPT 和总GSH 含量的影响
• 4.3.2 硫素对不同砷浓度条件下水稻幼苗砷吸收、积累的影响
• 4.4 过量施硫对砷胁迫条件下水稻植株生物量及抗氧化系统的影响
• 4.4.1 过量施硫对10μmol·L﹣1As 胁迫条件下水稻植株生物量及砷积累的影响
• 4.4.2 过量施硫对砷胁迫下水稻幼苗根部抗氧化系统酶活性及可溶性蛋白含量的影响
• 4.5 硫对不同砷形态处理中水稻砷吸收、代谢的影响
• 4.5.1 硫对不同砷形态处理中水稻生物量和磷浓度的影响
• 4.5.2 硫对不同砷形态处理中水稻砷积累的影响
• 4.5.3 硫对不同砷形态处理中水稻根部巯基积累的影响
• 4.5.4 硫对不同砷形态处理中砷由根系向地上部转运的影响
• 4.5.5 硫对不同砷形态处理中水稻根部 NPT 含量与亚砷酸盐比值的影响
• 4.5.6 硫对不同砷形态处理中水稻植株砷形态及含量的影响
• 4.5.7 硫对不同砷形态处理中水稻根部砷释放的影响
• 4.6 水稻植物螯合肽合成酶（PCS）基因的克隆及其植物表达载体的构建
• 4.6.1 水稻总RNA 的提取及质量检测
• 4.6.2 目的基因的克隆
• 4.6.3 2300 基因的序列分析
• 4.6.4 目的基因2300 表达载体的构建及酶切鉴定
• 5 讨论与结论
• 5.1 硅素对不同吸硅速率基因型水稻砷吸收、积累的影响
• 5.1.1 硅素对不同吸硅速率基因型水稻根系ATPase 活性、NPT 含量的影响
• 5.1.2 硅素对不同吸硅速率基因型水稻不同生育期砷吸收、积累的影响
• 5.2 硫素对水稻砷吸收、积累的影响
• 5.2.1 硫素对不同砷浓度条件下水稻NPT、GSH、PCs 及砷代谢的影响
• 5.2.2 过量施硫对砷胁迫条件下水稻植株生物量及抗氧化系统的影响
• 5.2.3 硫对不同砷形态处理中水稻砷吸收、代谢的影响
• 5.3 水稻植物螯合肽合成酶基因的克隆及功能分析
• 5.4 需要进一步深化研究的问题
• 参考文献
• 英文摘要