O-GlcNAc糖基转移酶对小鼠乳腺癌细胞迁移的影响

论文摘要

糖链及其缀合物不仅参与生命活动的基本生理生化过程,而且在疾病的发生和发展中发挥着重要作用。肿瘤细胞中的糖链与正常细胞相比有明显变化,包括表达过量或减少、出现新的结构等。糖链的合成没有模板,而是通过一系列定位有序的糖基转移酶完成的,糖基转移酶表达差异将直接导致糖链结构的变化。因此,从糖基转移酶入手可以从本质上阐明糖链在肿瘤发生和发展过程中的变化规律及调控作用。本实验以组织来源相同但转移能力不同的三株小鼠乳腺癌细胞67NR、4TO7、4T1为研究对象,利用基因芯片、实时定量PCR等技术系统地研究了小鼠迄今已知糖基转移酶在不同转移能力的肿瘤细胞中的表达谱和差异表达谱,发现了19个差异表达的糖基转移酶基因,它们可能与肿瘤的转移具有相关性。其中O-GlcNAc糖基转移酶（O-GlcNAc transferase, OGT）在不转移的67NR细胞中低表达,而在高转移的4T1细胞中高表达,其表达量为67NR的1.64倍。O-GlcNAc糖基转移酶主要对细胞质和核内蛋白质进行O- GlcNAc修饰。OGT蛋白含有两个功能结构域,氨基端的三十四肽重复序列（tetratricopeptiderepeat, TPR）和羧基端的催化结构域。O-GlcNAc修饰是一种动态的、可诱导的、可调控的修饰方式,与磷酸化相似。迄今发现的O-GIcNAc修饰蛋白都具有磷酸化修饰,而且其修饰位点常与磷酸化位点相同或相邻,即两种修饰方式之间存在相互影响。由于O-GIcNAc修饰与磷酸化修饰的“阴-阳”关系,O-GIcNAc修饰在许多生理和病理过程中发挥重要要作用。为探讨OGT在肿瘤细胞行为学方面的作用,我们利用RNA干扰技术在高转移的4T1细胞中抑制OGT基因的表达。通过实时荧光定量PCR技术、流式细胞技术检测RNA干扰对OGT基因表达的干扰效率;观察OGT干扰后细胞形态变化,并在体外检测了细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力。实验发现在4T1细胞中OGT基因沉默后,细胞增殖能力没有变化,迁移和侵袭能力有明显减弱。体外实验结果提示我们,O-GlcNAc修饰变化在肿瘤细胞迁移和侵袭中发挥重要作用。总之,本研究利用基因芯片技术系统地研究了不同转移能力的肿瘤细胞株中糖基转移酶的表达谱,发现了OGT等19个差异表达的糖基转移酶基因;并通过体外实验初步阐明了OGT促进小鼠乳腺肿瘤细胞的迁移和侵袭;为深入地研究糖基转移酶在肿瘤的发生和发展过程中的作用创造了条件。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 糖链与肿瘤
• 1.1 N-聚糖分支的变更
• 1.2 唾液酸数量、连键以及乙酰化的改变
• 1.3 N-羟乙酰神经氨酸在人肿瘤中的表达
• 1.4 糖胺聚糖表达的变更
• 1.5 糖基化的改变的粘蛋白的病理作用
• 1.6 癌细胞表面唾液酸化的Lewis结构和选凝素配体
• 1.7 半乳凝素和多聚乳糖胺的表达
• 2 糖基转移酶
• 2.1 糖基转移酶结构与功能
• 2.2 糖基转移酶反应的一般性质
• 2.3 糖基转移酶的程序性作用
• 2.4 糖基转移酶和疾病
• 3 O-GlcNAc 基转移酶
• 3.1 OGT结构
• 3.2 O-GIcNAc修饰的蛋白
• 3.3 O-GIcNAc修饰与磷酸化
• 3.4 O-GIcNAc修饰的功能
• 3.5 O-GIcNAc修饰与疾病
• 实验部分
• 第一部分 基因芯片和实时定量 PCR 技术检测小鼠乳腺癌细胞中差异表 达的糖基转移酶基因
• 1 材料
• 1.1 细胞系
• 1.2 主要试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 基因芯片材料
• 2 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 基因芯片实验和分析方法
• 2.3 实时定量PCR的实验和分析方法
• 3 结果
• 3.1 细胞总RNA质量的分析
• 3.2 基因芯片自身杂交结果分析
• 3.3 基因芯片杂交结果分析
• 3.4 定量PCR验证差异表达的糖基转移酶基因
• 4 讨论
• 第二部分 OGT 干扰细胞株的构建
• 1 材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 菌种和载体
• 1.3 试剂
• 1.4 仪器
• 2 方法
• 2.1 OGT干扰载体的构建
• 2.2 质粒的大量抽提
• 2.3 细胞转染和阳性克隆筛选
• 2.4 定量PCR检测OGT mRNA的表达
• 2.5 流式细胞仪检测细胞内O-GlcNAc糖链的表达
• 2.6 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 干扰载体构建
• 3.2 干扰片段对OGT mRNA的表达的影响
• 3.3 干扰片段对OGT表达活性的影响
• 4 讨论
• 第三部分OGT 基因沉默对小鼠乳腺癌细胞4T1 生物学特性的影响
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 细胞复苏
• 2.2 细胞培养及传代
• 2.3 MTT法检测细胞增殖活性
• 2.4 Transwell小室法测定细胞迁移能力
• 2.5 细胞侵袭能力的检测
• 2.6 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 MTT法检测OGT基因沉默后对乳腺癌细胞增殖活性的影响
• 3.2 Transwell小室法检测乳腺癌细胞体外迁移能力的变化
• 3.3 细胞侵袭能力的变化
• 4 讨论
• 总结和展望
• 参考文献
• 致谢