刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2基因的生物信息学分析、克隆表达及免疫保护性研究

论文摘要

实验目的对刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2（TgPGAM2）基因进行生物信息学分析,并对该基因进行克隆、表达,表达产物纯化后分析其免疫原性;观察重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2蛋白（rTgPGAM2）免疫小鼠诱导的黏膜及系统免疫应答及其抗弓形虫感染的能力,探讨TgPGAM2作为弓形虫疫苗候选抗原的可能性。实验方法第一部分:综述脊椎动物、无脊椎动物、原生动物等不同来源PGAM蛋白的理化性质及研究进展。第二部分:对TgPGAM2基因的主要特性及抗原表位进行生物信息学分析。利用蛋白分析专家系统（ExPASy）提供的ProtParam、SOSUI、TMHMM、HNN、MotifScan,NCBI上的ORF finder、Bcepred等生物信息学在线分析程序,结合Gene Runner、DNAman等生物信息学软件,分析、预测TgPGAM2蛋白的理化性质、可溶性、表面可及性﹑可塑性,跨膜区,翻译后修饰位点、亲（疏）水性、二级结构、抗原表位等。第三部分:构建重组质粒pET30a/TgPGAM2,并在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白。对原核表达的rTgPGAM2进行纯化及免疫原性分析。收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取总RNA;设计合成引物并引入Kpn I和BamH I酶切位点,RT-PCR扩增编码TgPGAM2的基因片段克隆到原核表达质粒pET30a中,阳性克隆经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆;在大肠杆菌BL21（DE3）中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE进行鉴定。大量表达rTgPGAM2,以Ni-NTA层析法纯化蛋白,用兔抗弓形虫血清做Western blotting分析其免疫原性。第四部分:观察不同剂量rTgPGAM2滴鼻免疫小鼠诱导的黏膜和系统免疫应答及抗弓形虫感染作用。BALB/c小鼠60只随机分为5组,免疫组分别用10μg、20μg、30μg、40μg rTgPGAM2/只滴鼻免疫小鼠,免疫2次,间隔2周,rTgPGAM2溶于20μl PBS中,对照组用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d,随机取每组5只小鼠,颈椎脱臼处死,检测肠液sIgA和血清IgG、IL-2、IL-4、IFN-γ,分离并计数肠上皮内淋巴细胞（intestinal intraepithelial lymphocytes,IEL）及脾淋巴细胞。其余35只小鼠每只用1×104个速殖子灌胃,观察小鼠健康情况。攻击后第30d,颈椎脱臼处死小鼠,计数肝、脑组织内弓形虫速殖子。实验结果通过生物信息学分析发现,刚地弓形虫PGAM2有10个表面可及性参数≥1.9的区域、3个亲水性参数得分≥1.9的区域、3个柔韧性参数得分≥2的区域、8个翻译后修饰位点、16个潜在抗原表位,可能具有免疫原性。以RH株弓形虫速殖子的cDNA为摸板,扩增获得756bp的TgPGAM2基因片段,并成功构建重组质粒pET30a/TgPGAM2;IPTG诱导后行SDS-PAGE分析,结果表明目的基因在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达,相对分子量（Mr）约30ku。Western blotting显示,纯化后的rTgPGAM2能被兔抗弓形虫免疫血清识别。30μg组血清IgG（A495=0.9704）、IFN-γ（A405=0.8456）,肠液IgA（A495=0.9098）高于20μg组（血清IgG、IFN-γ,肠液IgA A495分别为0.8213、0.7244、0.6504）,组间差别有统计学意义（F=8.741, F=4.53, F=6.94,P<0.05）。血清IL-2和IL-4组间差别无统计学意义。攻虫后第7～14d,各组小鼠均出现倦怠、活动减少、饮水及采食减少等表现,对照组小鼠死亡2只;40μg组1只。30μg组肝（58.3×105/g）、脑（3.99×105/g）组织内速殖子虫荷显著低于对照组（肝93.88×105/g、脑5.65×105/g）和10μg组（肝85.54×105/g、脑4.86×105/g）,组间差别有统计学意义（F=8.56,F=9.31,F=7.39,F=9.68,P<0.05）。结论通过生物信息学分析发现,刚地弓形虫PGAM2存在16个潜在的抗原表位,可能具有免疫原性。成功构建重组质粒pET30a/TgPGAM2并在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白。原核系统表达的rTgPGAM2具有免疫原性。30μg组rTgPGAM2滴鼻免疫更有效诱导了黏膜和系统免疫应答,并有效降低弓形虫感染鼠肝、脑组织中的虫荷。本研究的结果表明,刚地弓形虫PGAM2具有免疫原性,并能诱导有效的黏膜和免疫应答,有可能作为弓形虫疫苗的候选抗原。

论文目录

• 缩略词（Abbreviation）
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述 磷酸甘油酸变位酶（PGAM）研究进展
• 脊椎动物PGAM
• 无脊椎动物PGAM
• 原生动物PGAM
• 真菌和细菌PGAM
• 展望
• 参考文献
• 第二章 刚地弓形虫磷酸甘油酸酯变位酶2 基因编码蛋白主要特性与抗原表位的生物信息学分析
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三章 刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2 基因的克隆表达、纯化及免疫原性分析
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四章 rTgPGAM2 滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答及抗弓形虫感染作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附录Ⅰ ELISA 主要试剂溶液配制方法
• 附录Ⅱ第四章实验数据表
• 致谢
• 个人简历