番茄早疫病菌（Alternaria solani）广谱拮抗微生物的选育及拮抗机理研究

论文摘要

本研究用稀释法,对10个样品进行了广谱拮抗微生物的分离筛选,其中12株广谱拮抗菌进行了初步的分类鉴定。着重对番茄早疫病菌有较强拮抗作用的QM3菌株,进行了分子鉴定、激光诱变、发酵条件、拮抗机制、拮抗物质提取、防病促生和定殖等的深入研究,为番茄早疫病害的生物防治提供了理论依据。通过形态、生理生化和分子鉴定,12株广谱拮抗菌的初步鉴定结果为:8株细菌均属于芽孢杆菌属,其中QM3菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。放线菌QMS4属小多孢菌属。3株丝状真菌均归属于青霉属。根据发酵液的拮抗能力试验,选出对番茄早疫病菌拮抗作用最强的菌株QM3,采用He-Ne激光对菌株QM3进行诱变,筛选出对番茄早疫病菌、赤霉病菌、苹果干腐菌拮抗能力显著提高的突变菌株QM34（p＜0.05）。综合考虑生长量OD660和抑菌圈D两个指标,从8种不同的培养基优选出了YPF-Ca培养基。以此培养基为基础,设计了L27（3）7正交表,通过极差分析和方差分析的结果,得出了最优发酵条件组合A3B2C3D3E1F2G2。拮抗机制的研究表明,广谱拮抗芽孢杆菌QM34主要是通过产生抗菌物质、分泌水解酶和竞争防治相结合的拮抗机制,抑制番茄早疫病原菌;抗真菌物质能极显著的抑制番茄病原菌孢子的萌发和芽管的生长（p＜0.01）,并使番茄早疫病原菌菌丝发生致畸现象。抗菌物质的提取试验表明,用60%的饱和硫酸铵盐析,透析后可获得分子量大于3500Da的抗菌蛋白;用甲醇萃取得到抗菌物质,具有耐热、光、酸碱性和抗胰蛋白酶和蛋白酶K抗性。QM34无菌液在浓度倍数为-5～80的范围内,对番茄早疫病菌呈线性抑制,通过回归方程,得出QM34无菌液抑制番茄早疫病菌的EC50为3.02。防病促生试验表明,QM34菌株对番茄早疫病害有明显的防治效果,对番茄的生长有明显的促进作用,但不同的处理防治效果和促生作用是不同的;根围总芽孢杆菌的测定结果表明,QM34具有很强的竞争能力,能在根际大量繁殖。因此,枯草芽孢杆菌QM34是一株有潜在应用价值的广谱拮抗促生根际细菌。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 番茄早疫病害的研究进展
• 1.1 番茄简介
• 1.2 番茄的历史
• 1.3 番茄早疫病的研究史
• 1.3.1 发病规律
• 1.3.2 病害症状
• 1.3.3 综合防治
• 2 拮抗微生物研究现状
• 2.1 生物防治
• 2.2 微生物防治
• 2.3 拮抗微生物
• 2.3.1 拮抗微生物种类
• 2.3.2 拮抗微生物的筛选研究
• 2.3.3 拮抗微生物的拮抗机制的研究
• 2.3.4 拮抗微生物农药的应用研究
• 3 枯草芽孢杆菌拮抗物质的研究
• 3.1 蛋白类抗菌物质
• 3.2 抗菌肽类
• 4 生物菌肥的研究
• 第二章 番茄早疫病害广谱拮抗菌的分离筛选研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 采集的样品
• 1.1.2 供试植物病原真菌
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌、放线菌和丝状真菌的分离
• 1.2.2 广谱拮抗菌的初筛和复筛
• 2 结果与分析
• 2.1 拮抗菌的初筛结果
• 2.2 广谱拮抗菌的复筛结果
• 3 结论
• 4 讨论
• 附录2-1
• 附录2-2
• 附录2-3
• 第三章 番茄早疫病害广谱拮抗微生物的种属鉴定
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 试剂与染液
• 1.1.4 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 拮抗细菌的形态鉴定
• 1.2.2 生理生化鉴定
• 1.2.3 拮抗细菌的16S rDNA序列分析
• 1.2.4 拮抗放线菌的鉴定
• 1.2.5 拮抗真菌的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 拮抗细菌的鉴定结果
• 2.1.1 形态鉴定结果
• 2.1.2 生理生化指标的鉴定结果
• 2.1.3 16S rDNA序列分析
• 2.2 广谱拮抗放线菌的鉴定
• 2.3 广谱拮抗真菌的鉴定
• 3 结论
• 4 讨论
• 附录3-1
• 附录3-2
• 附录3-3
• 附录3-4
• 第四章 He-Ne激光诱变提高菌株QM3的拮抗能力
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌发酵液拮抗能力的测定
• 1.2.2 诱变处理
• 1.2.3 拮抗能力的检测试验
• 1.2.4 拮抗突变株遗传稳定性试验
• 1.2.5 数据分析
• 2 结果分析
• 2.1 拮抗细菌发酵液的拮抗能力比较
• 2.2 He-Ne激光对QM3菌株的影响
• 2.2.1 菌落形态的变化
• 2.2.2 菌落数的变化
• 2.3 拮抗能力分析
• 2.3.1 突变株筛选
• 2.3.2 正拮抗突变株的复筛
• 2.4 拮抗突变株遗传稳定性研究
• 3 结论
• 4 讨论
• 4.1 激光诱变育种
• 4.2 拮抗性能提高
• 4.3 突变株的遗传稳定性
• 附录4-1
• 第五章 广谱拮抗芽孢杆菌QM34发酵条件的研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 培养基的选择
• 1.2.2 生长量的测定
• 1.2.3 抑菌效果的测定
• 1.2.4 培养条件的优化
• 1.2.5 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 发酵培养基选择
• 2.2 发酵条件的优化
• 2.2.1 正交结果的极差分析
• 2.2.2 正交结果的方差分析
• 3 结论
• 4 讨论
• 4.1 碳源和氯化钙的影响
• 4.2 正交表的设计
• 第六章 芽孢杆菌QM34对番茄早疫病菌的拮抗机制
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 在PDA上对番茄早疫病菌的抑制试验
• 1.2.2 QM34产纤维素酶能力的检测
• 1.2.3 QM34产蛋白酶能力的检测
• 1.2.4 QM34对番茄早疫病菌菌丝形态的影响
• 1.2.5 QM34发酵液对番茄早疫病菌孢子萌发的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 QM34发酵液和无菌发酵液抑菌试验
• 2.2 QM34产纤维素酶和蛋白酶能力的测定
• 2.3 QM34发酵液对番茄早疫病菌菌丝的影响
• 2.4 QM34发酵液对番茄早疫病原菌孢子萌发的影响
• 3 结论
• 4 讨论
• 第七章 芽孢杆菌QM34抗菌物质的特性研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 提取方法的选择
• 1.2.2 抗菌蛋白的提取
• 1.2.3 甲醇提取抗菌物质
• 1.2.4 拮抗物质的稳定性研究
• 2 结果与分析
• 2.1 提取方法的选择
• 2.2 饱和硫酸铵盐析提取拮抗蛋白
• 2.2.1 最佳硫酸铵饱和度的确定
• 2.2.2 饱和硫酸铵沉淀拮抗粗蛋白
• 2.3 甲醇提取拮抗物质
• 2.3.1 甲醇提取拮抗物质
• 2.3.2 用水反萃取拮抗物质
• 2.3.3 荧光检测
• 2.3.4 紫外分析
• 2.3.5 静态吸附脱色处理
• 2.4 甲醇初提物的稳定性研究
• 2.4.1 热稳定性研究
• 2.4.2 pH稳定性研究
• 2.4.3 光稳定性研究
• 2.4.4 蛋白酶稳定性研究
• 3 结论
• 4 讨论
• 第八章 拮抗芽孢杆菌QM34的防病促生试验
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试作物和靶标
• 1.1.2 供试生防菌株
• 1.1.3 试验地点
• 1.1.4 药剂
• 1.1.5 试验设计
• 1.2 方法
• 50)的确定'>1.2.1 QM34无菌液对番茄早疫菌的有效中浓度(EC₅₀)的确定
• 1.2.2 番茄早疫病发生情况的调查方法
• 1.2.3 菌株QM34促生效果测定
• 1.2.4 芽胞杆菌QM34在根围的定植情况
• 2 结果与分析
• 50确定'>2.1 QM34无菌液对番茄早疫病菌的EC₅₀确定
• 2.2 对番茄早疫病盆栽的防治效果
• 2.2.1 三种品种的发病率情况
• 2.2.2 QM34发酵液接种时间的影响
• 2.2.3 目标菌株QM34发酵液和化学农药的联合防效
• 2.3 目标菌株QM34的促生效果
• 2.3.1 叶片数和株高的变化情况
• 2.3.2 植株根部的发育情况
• 2.3.3 番茄植株的其他特征指标比较
• 2.4 芽胞杆菌QM34在根围的定植情况
• 3 结论
• 4 讨论
• 第九章 结论与讨论
• 1 主要研究成果
• 2 主要创新点
• 3 有待进一步研究的问题
• 4 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间的成果