小鼠精原干细胞的富集、移植与培养及GDNF在精子发生中作用机制

论文摘要

精原干细胞具有自我复制和分化成精子的能力,是动物体内唯一能进行遗传信息传递的干细胞。因此,精原干细胞既是干细胞生物学的重要研究对象,又是研究精子发生、制作转基因动物和研究基因功能的重要资源。Brister等人于1994年创立的精原干细胞移植技术,以及Nagano等人于2001年和Hamra等人于2002年分别用不同的载体遗传修饰精原干细胞成功地产生了转基因小鼠或大鼠等研究为揭示精子发生过程和制作转基因动物提供了新的方法。然而,精原干细胞的体外长期培养却在很长的时间里没有获得成功。可喜的是,这一障碍被最近的研究所突破,日本和美国的几个实验室先后报道了小鼠和大鼠的精原干细胞能在体外长期培养和增殖。在本研究中,我们首先建立了一种分离和富集小鼠精原干细胞的体系,富集的小鼠精原干细胞在移植到受体睾丸后启动了精子发生过程,并产生了供体细胞来源的后代小鼠,对富集的精原干细胞进行体外培养表明,来自昆明白乳鼠的精原干细胞在我们设计的无血清培养基和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上能够增殖近1个月的时间。我们应用了DBA/2、ICR、KM（昆明白）三个品系的野生型小鼠和一个细胞普遍表达绿色荧光蛋白（EGFP）基因的ICR转基因小鼠。睾丸取自出生后4至5天（出生日定为0天）的雄性乳鼠,并通过两步消化酶消化法收集睾丸细胞。消化液I是含0.2%胶原酶IV或者V和200μg/ml DNA酶的D-PBS,消化液II是含0.2%胶原酶IV或者V、0.2%透明质酸酶和200μg/ml DNA酶的无血清DMEM。去掉睾丸白膜后的睾丸组织样品经PBS洗涤3遍后,用10倍体积的消化液I在室温下作用3至5分钟。在此期间,用吸管轻轻吹打。然后加入5至10毫升PBS,170g离心3分钟,反复3次以去除睾丸间质细胞,收集曲细精管样品。后者用5倍体积的消化液II消化2至5分钟,伴随着吸管反复吹打。消化好的细胞悬液中加入5至10毫升PBS或含10%血清的DMEM,混匀后,用60μm孔径的尼龙网过滤。滤出液于200g离心5分钟,反复洗涤3次。最后用贴壁分选培养基重悬细胞,接种到0.2%明胶包被的培养瓶,置于37°C、5%CO2培养箱中培养。睾丸中的支持细胞和间质细胞等体细胞对精原干细胞的增殖有负作用。为了尽快去除体细胞,我们采用含10%血清、2 mM谷氨酰胺、100 unit/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基对睾丸细胞进行差异贴壁分选。我们发现用此培养基培养睾丸细胞时,支持细胞贴壁快,而生精细胞只是贴附在支持细胞层上,并且易于吹打悬起,可通过轻轻吹打后,将漂浮的细胞转移至新的明胶包被的培养瓶中贴壁培养。我们连续贴壁分选3次,时间分别为接种后的1、4、20小时。第3次贴壁后是否转瓶培养要根据支持细胞的去除程度和生长状况而定。为验证差异贴壁分选的效率,我们对第3次贴壁培养过夜的分选出的细胞进行了流式分析,以新分离的未分选睾丸细胞的流式分析结果作为对照。检测抗原是Thy-1、EP-CAM和GFRα1等,这些抗原已被证明是精原干细胞标志抗原。流式分析结果表明,经过连续三次贴壁分选后,精原干细胞分别被富集了20.3、11、14.8倍。与以前报道的利用这三种抗原进行的免疫激活细胞分选和荧光激活细胞分选的效率相比,我们的

论文目录

缩略语表

中文摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

第一节精子发生及其调节

1 睾丸的形态、结构和功能

1.1 睾丸的形态与结构

1.2 睾丸的功能

1.3 曲细精管的组织结构

2 精子发生过程

2.1 广义的精子发生过程

2.2 狭义的精子发生过程

2.3 生精周期

3 精子发生过程中生精细胞的凋亡

3.1 生精细胞的生理性凋亡

3.2 导致生精细胞凋亡的因素

3.3 生精细胞凋亡的调节蛋白与通路

4 精子形成过程及基因表达调控

4.1 精子头部和顶体的形成

4.2 精子形成过程中细胞骨架蛋白的表达与装配

4.3 染色质凝聚和核浓缩中的分子事件

4.4 领及其作用

4.5 线粒体鞘的形成

4.6 精子形成过程中的基因表达调控

5 精子发生的调节

5.1 精子发生的内分泌调节

5.2 精子发生的旁分泌和自分泌调节

5.3 其它因素对精子发生的调节

第二节精原干细胞移植研究进展

1 精原干细胞的起源和一般生物学特征

1.1 SSCs 与精子发生

1.2 SSCs 的起源

1.3 SSCs 的一般生物学特征

2 精原干细胞移植研究简史

2.1 早期的研究报道:SSCs 同种移植

2.2 SSCs 异种/源移植

2.3 牛、羊、猴和人的睾丸注射

2.4 SSCs 冷冻保存后的移植

2.5 体外培养的SSCs 移植

3 精原干细胞移植技术

3.1 SSC 移植供体和受体动物的选择

3.2 SSC 移植方法

3.3 SSC 移植分析

3.4 受体睾丸中SSCs 克隆的形成过程

3.5 影响SSCs 移植效率的因素

4 精原干细胞移植技术的应用

4.1 物种保护和男性育性恢复

4.2 SSCs 体外培养的功能性评价系统

4.3 SSCs 的分离与鉴定

4.4 不育及基因敲除研究

4.5 精子发生机理研究

4.6 遗传病的基因治疗

4.7 用SSC 移植技术制作转基因动物

第三节精原干细胞体外培养的历史和现状

1 精原干细胞体外培养简史

1.1 SSCs 体外培养的早期尝试

1.2 小鼠SSCs 的培养

1.3 大鼠SSCs 的培养

1.4 其它哺乳动物SSCs 的培养

2 体外培养的精原干细胞的特征

2.1 体外培养的SSCs 的形态特征

2.2 SSCs 的生化和组化特征

3 SSCs 的分离与纯化

4 影响SSCs 体外增殖的因素

4.1 基本培养基和添加剂

4.2 血清

4.3 激素和维生素

4.4 生长因子

4.5 饲养层细胞和培养温度

4.6 动物种类和品系

5 已建立的SSCs 长期培养体系

5.1 Kubota’s 小鼠和大鼠SSCs 培养体系

5.2 Shinohara’s 小鼠 SSCs 培养体系

5.3 Hamra’s 大鼠SSCs 培养体系

6 培养的SSCs 的活性与功能鉴定方法

6.1 SSC 移植分析

6.2 精原干细胞指标

6.3 SSCs 标志分子检测法

7 精原干细胞自我复制的维持机制

7.1 GDNF 信号通路

7.2 bFGF 通路

7.3 Oct4 信号通路

7.4 其它因子和通路

第四节 GDNF 对睾丸功能的调节

1 GDNF 家族配体

2 GDNF 的特性及分子结构

3 GDNF 受体

4 GDNF 对睾丸功能的调节

4.1 GDNF 及其受体在睾丸中的表达状况

4.2 GDNF 与精子发生

4.3 GDNF 与睾丸发育

4.4 GDNF 调节血睾屏障的形成和功能

5 GDNF 信号通路

5.1 依赖RET 的GDNF 通路

5.2 不依赖RET 的GDNF 通路

参考文献

第二章研究论文

第一节小鼠精原干细胞移植和后代鼠的产生

中文摘要

ABSTRACT

1 引言

2 实验材料和实验方法

2.1 主要仪器

2.2 实验动物

2.3 主要试剂

2.4 重要溶液的配制

2.5 操作针的制备

2.6 培养瓶的明胶包被

2.7 乳鼠睾丸细胞的分离

2.8 SSCs 的差异贴壁分选

2.9 移植受体小鼠的准备

2.10 睾丸细胞的移植

2.11 移植分析

2.12 免疫细胞化学分析

3 结果与结论

3.1 不含胰酶的消化液消化睾丸组织提高了睾丸细胞的活力

3.2 差异贴壁分选方法是富集SSCs 的简单途径

3.3 差异贴壁分选出的SSCs 维持干细胞活性

3.4 来源于供体细胞的后代小鼠的产生

4 讨论

参考文献

第二节小鼠精原干细胞体外培养的研究

中文摘要

ABSTRACT

1 引言

2 实验材料和研究方法

2.1 主要仪器

2.2 主要药品和试剂

2.3 实验动物

2.4 培养基和培养条件

2.5 小鼠睾丸细胞的分离和收集

2.6 SSCs 的差异贴壁分选和培养

2.7 SSCs 标志基因表达的RT-PCR 分析

2.8 培养细胞的免疫细胞化学分析

2.9 流式细胞分析

2.10 溶液配制

3 结果与结论

3.1 SSCs 分离和富集方法的改良有助于睾丸体细胞的去除

3.2 睾丸细胞的差异贴壁分选富集了SSCs

3.3 Ms 支持SSCs 的体外增殖

3.4 培养的来自KM 小鼠的SSCs 的形态特征

3.5 SSCs 标志分子的检测

3.6 Oct4/Sox2 转录调控复合物可能在SSC 自我复制中起作用

3.7 SSCs 的体外增殖不需要LIF

4 讨论

参考文献

第三节 GDNF 对支持细胞的作用及其分子机制的研究

中文摘要

ABSTRACT

1 引言

2 研究材料和研究方法

2.1 主要仪器

2.2 试剂和实验动物

2.3 支持细胞分离、纯化和培养

2.4 MTT 活体染色法评定支持细胞活力

2.5 支持细胞增殖检测

2.6 免疫细胞化学分析

2.7 RT-PCR 分析

2.8 统计分析

3 结果与结论

3.1 小鼠未成熟支持细胞的纯度和形态特征

3.2 支持细胞中的GDNF 表达状况和激素调控

3.3 GDNF 促进支持细胞在体外的存活和增殖

3.4 GDNF 通过GFRα1/NCAM 通路促进支持细胞增殖

4 讨论

参考文献

发表和投送的文章

致谢

小鼠精原干细胞的富集、移植与培养及GDNF在精子发生中作用机制

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢