稻水象甲地理型孤雌生殖的研究

论文摘要

稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel（Coleoptera:Curculionidae）原分布于北美密西西比河流域,美国南部发生的为两性生殖型,上世纪50年代在美国西海岸发现的加利福尼种群、1976年传入亚州稻区日本、进而蔓延到朝鲜半岛和中国的均属孤雌生殖型。稻水象甲孤雌生殖现象对于其地理分布和种群扩张具有重要意义。为研究稻水象甲地理型孤雌生殖形成的机理,本文研究了虫口密度对稻水象甲假死行为的影响,采用染色体压片、电镜观察、AFLP和SSH等方法对稻水象甲进行染色体分析、卵巢切片观察、地理种群多态性分析,并构建卵巢孤雌生殖消减文库。实验结果如下:1)虫口密度对孤雌生殖稻水象甲假死行为和体重的影响初始虫口密度影响假死持续时间和发生假死需要的刺激次数,虫口密度越高,平均假死时间越长,需要的刺激次数越少,即虫口密度越高越容易发生假死。羽化天数对假死持续时间没有影响,但是在随着虫龄的增加,各虫口密度发生假死需要的刺激次数越少。虫口密度对虫重有影响,虫口密度为1时,虫重随着虫龄的增加而增加,虫口密度高则导致虫重下降。结果表明高虫口密度易导致假死,延迟迁飞,易形成二代虫源。2)染色体核型分析对于孤雌生殖稻水象甲和两性生殖稻水象甲雄虫染色体观察表明,两性生殖稻水象甲为二倍体,染色体条数为22条,性别决定机制为XY（?）/XX♀。孤雌生殖稻水象甲为三倍体,染色体条数为33条,未观察到性染色体。孤雌生殖和两性生殖稻水象甲染色体基数为11。3)卵巢结构和卵母细胞减数分裂的观察对于孤雌生殖稻水象甲卵巢的激光共聚焦显微镜观察表明,稻水象甲卵巢属于端滋式,在卵巢底部形成发育成熟的卵,但没有进行胚胎发育。透射电镜观察发现,滋养细胞和囊泡细胞里存在共生菌Wolbachia,但是卵母细胞内不存在共生菌,卵母细胞进行单极成熟分裂。这些结果说明,稻水象甲的孤雌生殖是由遗传因素决定的。4)两种生殖方式稻水象甲种群多态性研究收集不同地理种群的稻水象甲,进行AFLP分析,结果表明,两性生殖类群聚成一簇,孤雌生殖种群聚成一簇,意大利种群与亚洲种群亲缘关系更近,推测该地稻水象甲可能来自亚洲种群。两性生殖和孤雌生殖类群的相似系数较低,表明两者的亲缘关系较远。对于孤雌生殖共同分离片段的序列分析表明,与慢性Fos相关抗原FRAs、磷脂酰肌醇-4激酶、海藻糖酶同源性高的DNA片段,可能与孤雌生殖形成的分子机制有关。5)消减文库的构建和序列分析以孤雌生殖稻水象甲卵巢cDNA样品作为tester,两性生殖稻水象甲雌虫卵巢cDNA样品作为driver,构建消减文库,序列分析表明,克隆号SSH4和SSH12、SSH98、SSH108分别与信号转导、微管蛋白、细胞周期蛋白等功能相关,推测这些基因片段的功能与孤雌生殖发生的细胞学过程有关。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 昆虫孤雌生殖的种类
• 1.1 单倍体孤雌生殖
• 1.2 自体融合
• 1.3 无融合生殖
• 1.4 核内有丝分裂
• 2 昆虫孤雌生殖的起源
• 2.1 自发起源
• 2.2 杂种起源
• 2.3 传播起源
• 2.4 感染起源
• 3 昆虫进行孤雌生殖的细胞学基础—中心体的形成
• 3.1 中心体
• 3.2 中心体在昆虫孤雌生殖中的作用
• 4 昆虫的卵巢结构和卵母细胞减数分裂的研究
• 4.1 昆虫卵巢的结构类型
• 4.2 卵子发生
• 5 鞘翅目昆虫染色体的研究
• 5.1 鞘翅目昆虫染色体研究方法
• 5.2 鞘翅目昆虫的染色体研究现状
• 6 AFLP标记及其在昆虫学研究中的应用
• 6.1 AFLP的技术原理
• 6.2 AFLP在昆虫遗传学、系统学和分子生物学研究中的应用
• 6.2.1 构建遗传图谱
• 6.2.2 遗传多样性和亲缘关系研究
• 6.2.3 基因标记及定位
• 6.2.4 植物抗虫基因的研究
• 7 抑制性消减杂交技术及其在基因克隆上的应用
• 8 稻水象甲和地理型孤雌生殖
• 8.1 地理型孤雌生殖与多倍体现象
• 8.2 稻水象和地理型孤雌生殖
• 9 本研究的目的和意义
• 第二章 虫口密度对孤雌生殖稻水象甲假死行为的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 寄主植物
• 1.2 供试昆虫
• 1.3 实验设计
• 1.3.1 成虫饲养
• 1.3.2 取食斑、虫重、假死的测量
• 1.3.3 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 初始密度、当前密度、羽化天数对假死时间的影响
• 2.2 虫口密度和羽化天数对假死时间的影响
• 2.3 虫口密度和虫龄对刺激次数的影响
• 2.4 虫口密度对虫重的影响
• 2.5 假死时间、刺激刺激次数和体重的相关性
• 3 讨论
• 3.1 虫口密度对假死的影响
• 3.2 高龄稻水象甲是否更容易假死?
• 3.3 假死是否会增加扩散机会?
• 第三章 孤雌生殖和两性生殖稻水象甲染色体核型分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试虫源
• 1.2 试剂
• 1.3 配方
• 1.4 实验方法
• 1.5 显微镜观察
• 1.6 染色体分析
• 2 结果与分析
• 2.1 两性生殖型稻水象甲雄虫精母细胞的减数分裂和染色体观察
• 2.2 孤雌生殖稻水象甲的染色体观察和核型分析
• 1) 卵巢中卵母细胞染色体和卵的染色体观察
• 2) 染色体核型分析
• 3 讨论
• 第四章 孤雌生殖稻水象甲卵巢结构和卵母细胞分裂的观察
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂
• 1.2 供试昆虫
• 1.3 细胞骨架的观察与分析
• 1.4 卵巢结构的观察
• 1.5 卵巢的透射电镜观察
• 2 结果与分析
• 2.1 卵巢结构的观察
• 2.2 卵母细胞减数分裂的观察
• 3 讨论
• 第五章 两种生殖方式稻水象甲地理种群的遗传多态性
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 试剂
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 基因组DNA的提取
• 1.3.2 基因组DNA的双酶切
• 1.3.3 接头制作
• 1.3.4 酶切产物加接头
• 1.3.5 预扩增
• 1.3.6 选择性扩增
• 1.3.7 凝胶制备
• 1.3.8 电泳
• 1.3.9 银染
• 1.3.10 凝胶扫描、分析
• 1.3.11 聚类分析
• 1.3.12 特异条带的回收
• 1.3.13 目的片段回收纯化
• 1.3.14 载体连接
• 1.3.15 感受态细胞的制备
• 1.3.16 转化
• 1.3.17 挑取阳性克隆
• 1.3.18 阳性克隆的检测
• 1.3.19 测序
• 2 结果与分析
• 2.1 基因组DNA的提取
• 2.2 基因池的构建
• 2.3 酶切效果
• 2.4 AFLP分析
• 2.4.1 遗传多态性分析
• 2.4.2 各地理种群遗传相似性分析和聚类分析
• 2.5 差异片段序列分析
• 2.5.1 共分离片段的克隆测序
• 2.5.2 序列分析
• 1) 能量代谢相关基因
• 2) 细胞增殖与分化相关基因
• 3) 信号转导途径相关基因
• 4) 功能未知基因
• 3 讨论
• 3.1 稻水象甲遗传分化
• 3.2 孤雌生殖形成的一些可能的分子机制
• 第六章 孤雌生殖与两性生殖稻水象甲卵巢cDNA消减文库的构建与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 试剂
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 RNA提取
• 1.3.2 RNA电泳
• 1.3.3 第一链cDNA合成
• 1.3.4 第一链cDNA合成的纯化
• 1.3.5 第二链cDNA的合成
• 1.3.6 双链cDNA的纯化
• 1.3.7 RsaI酶切
• 1.3.8 酶切产物的纯化
• 1.3.9 Tester样品酶切产物加接头
• 1.3.10 抑制性消减杂交——第一轮杂交
• 1.3.11 抑制性消减杂交——第二轮杂交
• 1.3.12 巢式PCR扩增——第一次PCR扩增
• 1.3.13 巢式PCR扩增——第二次PCR扩增
• 1.3.14 T载体连接
• 1.3.15 转化
• 1.3.16 挑取阳性克隆
• 1.3.17 阳性克隆的检测
• 1.3.18 阳性克隆测序
• 1.3.19 差减效果检验
• 1.3.20 序列结果分析
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA的提取
• 2.2 双链cDNA的合成
• 2.3 双链cDNA的纯化
• 2.4 孤雌生殖和两性生殖稻水象甲卵巢cDNA的酶切
• 2.5 孤雌生殖和两性生殖稻水象甲卵巢cDNA的酶切产物的纯化
• 2.6 巢式PCR扩增
• 2.7 消减文库的构建
• 2.8 消减结果的验证
• 2.9 孤雌生殖相关序列分析
• 1) 细胞结构相关基因
• 2) 糖、蛋白质合成和代谢相关基因
• 3) 细胞内运输机制相关基因
• 4) 能量传递相关基因
• 5) 转录相关基因
• 6) 细胞信号转导相关基因
• 7) 细胞周期蛋白和凋亡相关基因
• 8) 功能不明确基因
• 3 讨论
• 3.1 细胞结构相关基因
• 3.2 糖、蛋白质合成和代谢相关基因
• 3.3 细胞内运输机制相关基因
• 3.4 能量传递相关基因
• 3.5 转录相关基因
• 3.6 细胞信号转导相关基因
• 3.7 细胞周期蛋白和凋亡相关基因
• 第七章 结论和总讨论
• 7.1 虫口密度对假死行为的影响
• 7.2 三倍体、孤雌生殖和Wolbachia
• 7.3 两种生殖方式稻水象甲的地理种群多态性
• 7.4 孤雌生殖形成的可能分子机制
• 7.5 本论文的创新之处
• 7.6 今后的研究方向
• 参考文献
• 附录