雷帕霉素等免疫抑制剂影响肝癌生长及复发转移的实验和临床研究

论文摘要

原发性肝癌是亚洲及非洲大陆最常见的恶性肿瘤之一，手术切除是其首选治疗方法。但由于肝癌多合并伴有不同程度的肝硬化，使手术切除受到极大的限制，在很多情况下肝移植成为治愈肝癌的唯一选择。从某种程度来说，肝移植也可能是治疗肝癌的最佳手段之一，因为肝移植能最大限度的切除肿瘤及移除硬化的肝脏，从根本上消除肝癌产生的土壤，预防肿瘤的复发；同时可避免出现肝切除术后肝功能衰竭等致死性并发症。由于供肝的短缺，肝癌肝移植术后肿瘤的转移复发引起了人们格外的关注，对其疗效的评价也更为谨慎。既往认为，肝癌肝移植术后免疫抑制剂的应用可能促进了术后肿瘤的转移复发；但事实上，并不是每一种免疫抑制剂都会促进肿瘤的生长。不同免疫抑制方案对肝癌肝移植术后肿瘤的转移复发可能有不同的影响，但目前此方面的系统研究还较少。在此，我们将探讨三种主要的免疫抑制剂（他克莫司，雷帕霉素和环孢素）对肝癌生长及转移复发的影响及相关机制，为肝癌肝移植术后免疫抑制方案的选用提供可借鉴的依据。第一部分：雷帕霉素等免疫抑制剂对肝癌生长及转移的实验研究体内试验中，利用复旦大学肝癌研究所（以下简称我所）建立的高转移人肝癌裸鼠模型LCI-D20，探讨目前临床上常用的三种免疫剂（他克莫司，雷帕霉素和环孢素）对裸鼠移植瘤生长及自发肺转移的影响。用免疫组化及TUNEL法分别检测移植瘤组织中细胞增殖核抗原（PCNA）、微血管密度（MVD）及细胞调亡水平的改变。结果表明，与对照组相比，雷帕霉素抑制了LCI-D20模型移植瘤的生长（瘤重0.76+0.38g vs．2.09+0.75g，P=0.001；肿瘤体积0.65±0.31 cm3 vs．2.11±1.02 cm3，P=0.003）及肺转移的发生（3/7 vs．7/7，P=0．007）；环孢素组肺部转移灶的数目较对照组明显增多（6±2 vs．4±1，P=0.046）；他克莫司组肺转移发生率虽较对照组减少，但无显著性差异（5/7 vs．7/7，P=0.078）；环孢素及他克莫司均对移植瘤的生长无影响（P＞0.05）。进一步的研究表明，与对照组相比，雷帕霉素抑制了移植瘤组织中PCNA的表达（免疫组化阳性指数244932.2±20998.6 vs．252766.7±29221.4，P=0.029）；降低了肿瘤组织中的微血管密度（29±5 vs．37±4，P=0.009）；同时促进了肿瘤细胞的调亡（25.3％±2.7％vs．13.9％±2.6％，P=0.000）；而他克莫司及环孢素对上述三方面均无显著影响。体外实验中，采用扫描电镜、肌动蛋白聚合实验、MTT、流式细胞仪、Boyden小室、明胶酶谱法分别研究各免疫抑制剂对人肝癌高转移细胞株MHCC97H增殖、凋亡、细胞周期、运动、黏附及侵袭的影响。用real-time PCR、western blot等方法探讨免疫抑制剂对与肿瘤进展相关的分子，如E-cadherin，、ICAM-1，、MMP-2等表达的影响。结果表明，与对照组相比，环孢素促进了MHCC97H细胞侵袭性表型的改变，运动、侵袭能力的增强及F型肌动蛋白的聚合。另外，环孢素还促进了细胞及肿瘤组织中MMP-2的表达。雷帕霉素则抑制了MHCC97H细胞的增殖，并使细胞周期停滞于G0-G1期，但并未促进细胞调亡。雷帕霉素及他克莫司均抑制了MHCC97H细胞的运动、侵袭和黏附，同时两者还抑制了ICAM-1和MMP-2在细胞及肿瘤组织中的表达。从上述结果中我们可以得到初步的结论：环孢素促进了肝癌细胞的转移；他克莫司至少不促进肝癌细胞的转移；而雷帕霉素则抑制了肝癌细胞的增殖及转移。第二部分：雷帕霉素抗肝癌血管形成机制的初步研究前述的研究发现，雷帕霉素抑制肿瘤血管形成是其抑制移植瘤生长与肺转移的重要机制之一。然而，雷帕霉素抗肝癌血管形成的具体分子机制仍未得到阐明。在此，我们先用基因芯片技术进行初步地筛选，接着用实时定量荧光PCR、Western blot和免疫组化来进一步验证，结果发现雷帕霉素抑制了移植瘤组织中VEGF、HIF-1a和Angiopoietin-2的表达。体外实验中，用CoCl2模拟缺氧环境，发现随着时间的推移，雷帕霉素抑制了MHCC97H细胞中VEGF及HIF-1a的表达，且两者随时间变化的趋势是完全一致的。而HIF-1α是目前公认的能与VEGF基因启动子结合并调节VEGF表达的细胞内转录因子。据此推测，雷帕霉素下调VEGF的表达可能是通过下调HIF-1α的表达实现的。我们的结果亦提示，雷帕霉素抑制肝癌细胞中VEGF蛋白及Ang-2蛋白的分泌，可能是其抗肝癌血管生成的重要机制之一。在雷帕霉素与干扰素α的联合干预实验中发现，对照组、雷帕霉素治疗组（2mg/kg/day）、干扰素α治疗组（1×106U/kg/day）和联合用药组的肿瘤体积分别为：4.10cm3±0.58cm3、1.82cm3±0.90cm3、0.70cm3±0.39cm3和0.20cm3±31cm3；肺转移发生率分别为：100％、83.3％、50％和0％。联合用药组的抑瘤效果较干扰素α治疗组明显增强（P=0.000），但与雷帕霉素治疗组相比无显著性差异（P=0.128）。与单独用药组相比，联合用药组明显抑制了肿瘤肺转移的发生（与雷帕霉素组比较P=0.023，与干扰素α组比较P=0.000）。因此，雷帕霉素与干扰素α合用在抗肿瘤方面具有协同效应。目前干扰素α已被用于治疗肝移植术后丙肝的复发，可以预见，两者合用在肝移植术后、尤其是在肝癌肝移植术后用于预防肿瘤转移复发方面可能有一定的临床应用前景。第三部分：雷帕霉素等免疫抑制剂对荷瘤肝移植大鼠肿瘤生长及肝癌肝移植大鼠术后肿瘤转移复发的实验研究我们已在本文第一、第二部分中详细探讨了雷帕霉素、环孢素和他克莫司三种免疫抑制剂在联合免疫缺陷裸鼠体内对肿瘤生长的影响。在这部分，我们将进一步探讨这三种免疫抑制剂在免疫功能正常的大鼠体内对肿瘤生长的影响。在第一组模型中，以Wistar大鼠作为供体，SD大鼠作为受体，建立急性排斥大鼠肝移植模型，术后即开始服用免疫抑制剂：雷帕霉素（1mg/kg/d，灌胃）、他克莫司（1mg/kg/d，灌胃）、环孢素（20mg/kg/d，灌胃）；术后3天，受体大鼠左肩胛区皮下注射腹水瘤Wlaker-256细胞。同法建立同基因肝移植大鼠（以SD大鼠作为供体及受体）皮下荷瘤模型，以生理盐水灌胃作对照，每周3次记录各组受体大鼠皮下肿瘤的生长情况，绘制成瘤曲线；并于皮下种植肿瘤术后14天处死大鼠，检测受体大鼠的肝功能、移植肝病理、脾细胞的NK活性及皮下肿瘤大小。在第二组模型中，我们将大鼠皮下Wlaker-256瘤块接种于SD大鼠肝左叶上，建立移植性大鼠肝癌模型。造模成功后14天再行原位肝移植术（以SD大鼠作为供体及受体），术后应用不同的免疫抑制剂（用法同上），以生理盐水灌胃作对照，观察肝癌肝移植术后各组大鼠肿瘤转移复发的情况。结果表明，与急性排斥大鼠相比，第一模型组中的受体大鼠在应用各免疫抑制剂后肝功能明显改善、移植物未出现严重的急性排斥反应、脾细胞的NK活性均受到明显的抑制；同时，与生理盐水对照组相比，雷帕霉素明显抑制了大鼠皮下肿瘤的生长（1.41±0.87cm3vs．3.65±0.87cm3，P=0.047），环孢素及他克莫司则促进了皮下肿瘤的生长（9.56±2.81cm3vs．3.65±0.87cm3，P=0.000；8.11±1.69cm3vs．3.65±0.87cm3，P=0.001）。在第二组模型中，肝癌肝移植大鼠术后分别接受了生理盐水、环孢素、他克莫司和雷帕霉素的治疗，各组大鼠肝内肿瘤的复发率分别为：0％、20％、16.7％、0％；肺转移的发生率分别为：42.9％、60％、33.3％、0％。与对照组相比，雷帕霉素抑制了肝癌肝移植大鼠术后肺转移的发生；术后肝内复发灶的出现仅见于他克莫司及环孢素组。综上所述，雷帕霉素在有效的保护移植物的同时抑制了移植受体体内肿瘤的生长；环孢素和他克莫司虽然抑制了机体的排斥反应，但也同时促进了受体体内肿瘤的生长。第四部分：我所134例肝癌肝移植的临床回顾分析及雷帕霉素的临床应用评价为了了解影响肝癌肝移植预后的一些重要因素及评价雷帕霉素在肝癌肝移植中的应用价值，我们回顾分析了复旦大学肝癌研究所从2004年1月到2005年10月共134例肝癌肝移植的临床资料（包括年龄、性别、肝炎病史、术前Child-Pugh分级、术中输血量、AFP、肿瘤大小、数目、包膜、微血管侵犯（MVI）、肿瘤分化程度、是否符合Milan标准及术后免疫抑制方案等），和术后随访资料（包括肿瘤转移复发情况、生存情况等）。134例肝癌肝移植患者术后1年、2年累积生存率分别为82.75％±3.47％、68.80％±7.07％，1年、2年累积无瘤生存率分别为69.13％±4.42％、41.33％±17.20％。单因素分析发现，术前Child-Pugh评分（P=0.000）、术中输血量（P=0.037）、肿瘤大小（P=0.032）、MVI（P=0.019）、是否符合Milian标准（P=0.007）是影响肝癌肝移植患者生存率的重要因素；术前Child-Pugh评分（P=0.009）、肿瘤数目（P=0.041）、肿瘤大小（P=0.002）、MVI（P=0.000）、pTNM分期（P=0.001）、是否符合Milian标准（P=0.000）是影响肝癌肝移植患者无瘤生存率的重要因素。多因素分析发现，术前Child-Pugh评分（P=0.000）、是否符合Milian标准（P=0.001）是影响肝癌肝移植患者生存率的独立预后因素；术前Child-Pugh评分（P=0.009）、是否符合Milian标准（P=0.004）、MVI（P=0.004）是影响肝癌肝移植患者无瘤生存率的独立预后因素。以是否符合Milan标准为依据，将134例肝癌肝移植患者分为2组。在符合Milan标准的61例肝癌肝移植患者中，多因素分析发现，术前Child-Pugh评分（P=0.043）是影响患者生存率的独立预后因素；MVI（P=0.014）是影响患者无瘤生存率的独立预后因素。在不符合Milan标准的73例肝癌肝移植患者中，与术后使用以他克莫司为基础的免疫抑制方案的患者（46例）相比，术后应用以雷帕霉素为基础的免疫抑制方案的患者（27例）其生存率（P=0.011）及无瘤生存率（P=0.037）均明显提高，且复发时间明显延迟（263.0±100.0天vs．140.1±123.5天，P=0.035）；单因素及多因素分析均提示，术后使用的免疫抑制方案是影响患者预后的重要因素；服用雷帕霉素的患者随访期间出现急性排斥反应5例、血小板减少2例、贫血6例、口腔溃疡7例，均得到及时的治疗而痊愈。因此我们可得出以下的结论，对于不符合Milan标准的肝癌肝移植患者，术后转换为以雷帕霉素为基础的免疫抑制方案可能有助于提高患者的生存期，同时患者对雷帕霉素也有良好的耐受性。对于肝癌肝移植术后肿瘤转移复发的预测，术前只能依据一些影像学的资料（如肿瘤的大小、数目等）来判断，术后则必须依据病理情况（如MVI等）重新修正原有的判断，制定治疗方案。同时，肝癌肝移植患者的预后不仅与肿瘤情况有关，与患者手术时的肝功能也密切相关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分: 雷帕霉素等免疫抑制剂影响肝癌生长及转移的实验研究
• Ⅰ.免疫抑制剂对高转移裸鼠人肝癌模型移植瘤生长及肺转移的影响
• 材料和方法（Ⅰ）
• 结果（Ⅰ）
• Ⅱ:免疫抑制剂对人肝癌细胞MHCC97H增殖、运动、侵袭能力的实验研究
• 材料和方法（Ⅱ）
• 结果（Ⅱ）
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分: 雷帕霉素抗肝癌血管形成机制的初步研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分: 雷帕霉素等免疫抑制剂影响荷瘤肝移植大鼠肿瘤生长及肝癌肝移植大鼠术后肿瘤复发转移的实验研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分: 复旦大学肝癌研究所134例肝癌肝移植的临床回顾分析及雷帕霉素的临床应用评价
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 图表
• 参考文献
• 文献综述1
• 文献综述2
• 附录: 研究生期间完成的论著目录
• 致谢