论文摘要
目的：探讨愤怒情志特质与神经递质代谢酶基因多态性的关系,并分析愤怒情志特质各维度间的相关性。方法：1.状态-特质怒表达量表Ⅱ问卷调查以河南中医学院在校正常大学生为调查对象,经伦理委员会批准并签署知情同意书后,采用整群随机抽样法获取调查样本。共发放问卷2864份,其中有效问卷2642份,占92.25%。以特质怒部分分值>x+s为高特质怒、分值<x-s为低特质怒,区分出高特质怒者共计364人,低特质怒者共计473人。根据本实验所需样本量,应从上述高特质怒者中按得分由高到低取236人、低特质怒者中按得分由低到高取236人作为受试者。经过集中抽血、提取DNA和基因分型等步骤,排除未参加抽血者及提取DNA过程中损失的血样,对最终的高特质怒组225例,低特质怒组221例的数据进行统计分析。2.挑选基因多态性位点查阅相关文献,选择国外已有初步研究的色氨酸羟化酶（TPH）基因A218C（rs1800532）位点,儿茶酚胺氧位甲基转移酶（COMT）基因V158M（rs4680）位点,单胺氧化酶A（MAOA）基因30bp-uVNTR位点,做进一步研究；此外,还选取了上述三种神经递质代谢酶基因中较小且研究相对较少的MAOA基因,从人类基因组单体型图（HapMap）中选出能代表汉族人该基因SNP阳性信号的tag SNP,即rs5906597、rs2235186、rs1181275和rs5905613,同时还选取该基因中的一个功能性SNP位点rs58524323,做探索性的研究。3.DNA提取（1）标本的采集和处理征得知情同意后,用负压采血管对合格受试者行静脉穿刺采血5ml （2% EDTA-Na2200μl抗凝）,血样置-20℃冰箱保存,两周内提取DNA。（2）DNA的提取方法将-20℃低温冷冻保存的血样于室温水浴解冻,将600μl血样移入EP离心管,加入等体积红细胞裂解液,充分混匀后12000转/min离心,吸去含有裂解红细胞的上清液。加入白细胞裂解液450μl,打碎沉淀物。向离心管中加入10%SDS40μl,充分混匀10min,再加入蛋白酶K10μl,上下颠转离心管轻柔混匀,置于37℃水浴过夜。将溶液冷却至室温,加入等体积Tris饱和酚,将离心管置于旋转器上充分混匀10min,使两相形成乳浊液；混匀后12000转/min离心5min,用宽口移液管吸取上层水相层移至新的离心管中,加入等体积的酚/氯仿（体积比1/1）500μl,充分混匀使两相形成乳浊液；混匀后10000转/min离心5min,用宽口移液管吸取上层水相层移至新的离心管中,加入等体积的氯仿,再次充分混匀,而后12000转/min离心10min。用宽口移液管将水相转移至新的离心管,在水相中加入1/10体积3mol/L的NaCl和800μ1冷无水乙醇,颠转离心管轻柔混匀,沉淀DNA,12000转/min离心5min。用70%冷乙醇重悬DNA沉淀,12000转/min离心10min,弃去上清,反复洗涤三次,室温干燥后溶于适量灭菌水中,-20℃保存备用。4.基因分型（1）PCR扩增目的片段以基因组DNA为模板,分别使用下列各对引物PCR扩增目的片段。引物设计所需的基因组DNA序列均来自美国国家生物信息中心（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。所有引物序列均采用Primer Premier 5.0软件设计。引物的设计与合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。待测多态性位点PCR扩增引物的名称、序列（5’-3’）、扩增产物长度如下。rs1800532：上游引物F GCATTTAGAATGGTACCTGGC下游引物R CACCACTCGATGCAACATTTG扩增的产物长度为231bprs4680：上游引物F TACTGTGGCTACTCAGCTGTG下游引物R TTCAGTGAACGTGGTGTGAAC扩增的产物长度为240bprs5906957：上游引物F CAGATTACTAGAGTAGGCTCC下游引物R GGTTACAGAGGTTATTGGCAG扩增的产物长度为230bprs2235186：上游引物F AGAATGAAGCTGGAGAGAGAG下游引物R TTGAATAGGAGGTCACCTGTC扩增的产物长度为233bprs1181275：上游引物F CTTCACTTCCATTCCTACTCC下游引物R AAGTAGTAAAATGAAGGTATG扩增的产物长度为190bprs5905613：上游引物F CCACAATAGATAACCTTGGGC下游引物R CCTGGGCCAAAAATGCTATTC扩增的产物长度为222bprs58524323：上游引物F CATGACATTCTCTGACTCCTG下游引物R CAGAACAGACACATACACACC扩增的产物长度为229bpMAOA基因30bp-uVNTR:上游引物F FAM-AGCACGCGTGCCTCAGCCTCCTTCCCCGGC下游引物R CCGAGATTCGGCGGGCCCTCCGCCTTGCGC扩增的产物长度为140-230bpPCR反应体系：模板DNAlμl,10XPCR缓冲液1.5μl, MgCl2 （25mM） 1.5μl, dNTP （10mM） 0.3μ1, Taq酶1.25U,引物各0.25μl,使用去离子水补足体积至25μl。PCR反应条件：94℃预变性2分钟；94℃变性15秒、60℃退火15秒、72℃延伸30秒共35个循环；72℃延伸3分钟。扩增完成后,1.2%琼脂糖凝胶电泳获得目的核苷酸片段。（2）SNP位点连接酶检测反应针对每个位点设计分别用于识别两种不同碱基的左端探针（长度相差3bp）,以及带荧光（FAM）的右端共用探针,终产物长度差别即为左端探针的长度差别。LDR探针由上海捷瑞生物工程有限公司设计、合成,探针名称、序列（5’-3’）、连接产物长度如下。rs 1800532左端探针TA:TATTAATTGACAACCTATTACGTGA左端探针TC:TTTTATTAATTGACAACCTATTACGTGC右端公用探针：P-TAGCTGCTATTCTGAGCATAGGGAA-FAM连接产物的大小分别为：50/A和53/C；rs4680左端探针TA:TTTTCAGCGGATGGTGGATTTCGCAGGCA左端探针TG:TTTTTTTCAGCGGATGGTGGATTTCGCAGGCG右端公用探针：P-TGAAGGACAAGGTGTGCATGCCTGATTT-FAM连接产物的大小分别为：57/A和60/G；rs5906957左端探针TA:TTTTTTTTTCAGATTTTAGCATTTCCCTCCTCA左端探针TG:TTTTTTTTTTTTCAGATTTTAGCATTTCCCTCCTCG右端公用探针：P-AGACCTTCCAACGGCTCCCCTTCTCTTTTTT-FAM连接产物的大小分别为：64/A和67/G；rs2235186左端探针TC:TCAGAAAGAAAGGGCAGCTCTTAAG左端探针TT:TTTTCAGAAAGAAAGGGCAGCTCTTAAA右端公用探针：P-ATAAACAGCTGTAACCTGATCATTC-FAM连接产物的大小分别为：50/C和53/T；rs1181275左端探针TC:TTTTCATTTTCATTCATTTCTCCTTATAC左端探针TT:TTTTTTTCATTTTCATTCATTTCTCCTTATAT右端公用探针：P-GATTTATCCTTCCTATATATTTTTGTTT-FAM连接产物的大小分别为：57/C和60/T；rs5905613左端探针TC:TTTTTTTTTACCAAATTCCTCACTATCACAGGC左端探针TT:TTTTTTTTTTTTACCAAATTCCTCACTATCACAGGT右端公用探针：P-TGTACCATTTGTACTTGAGCCAGCATTTTTT-FAM连接产物的大小分别为：64/C和67/Trs58524323左端探针TA:TTTTTTTTTTTTATATTCACAAAAAGATAAGCTAACT左端探针TG:TTTTTTTTTTTTTTTATATTCACAAAAAGATAAGCTAACC右端公用探针：P-GCCTAGCAGTCCTGTTCATAGAACATTTTTTTTT-FAM连接产物的大小分别为：71/A和74/G10μl连接体系为：PCR产物3μl、10×Taq DNA ligase buffer 1μl、Taq DNA ligase5U,特定LDR探针各0.1pmol,去离子水补足体积至10μL。连接反应参数：94℃变性30秒、60℃退火并连接3分钟,循环20次。反应结束后,4℃保存待用。（3）反应产物的扫描和结果的读取分别取1μl上述七个SNP多态性位点的连接反应产物及VNTR多态性位点的PCR产物,加10μl上样buffer（已混入Marker）,95℃变性3分钟,立即冰水浴。反应产物经ABI 3730XL测序仪扫描,根据目的峰与Marker的位置差距来读取结果。5.统计分析数据资料采用SPSS13.0进行统计分析。定性资料采用频率指标描述,组间比较采用卡方检验；不同基因型的得分采用均数加减标准差（x±s）描述,并进行单因素方差分析；相关分析采用线性相关,并计算Pearson相关系数。所有的统计检验均采用双侧检验,检验水准a=0.05,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果：1.高、低特质怒组8个多态性位点基因型和等位基因频率分布比较：差异均无统计学意义（P>0.05）。2.8个基因多态性位点各基因型组怒的表达部分得分比较：高特质怒组中,对于TPH基因A218C位点各基因型组,发怒（AX-O）得分差异有统计学意义（F=3.252,P=0.041）,女性怒的表达（AX）得分差异有统计学意义（F=6.668,P=0.002）,男性郁怒（AX-I）得分差异有统计学意义（F=4.693,P=0.012）；其余各基因多态性位点不同基因型组怒的表达、发怒、郁怒的得分差异无统计学意义（P>0.05）。低特质怒组中,TPH基因A218C位点各基因型组郁怒得分差异有统计学意义（F=3.113,P=0.046）；其余各基因多态性位点不同基因型组怒的表达、发怒、郁怒的得分差异无统计学意义（P>0.05）。3.8个基因多态性位点各基因型组怒的控制部分得分比较：高特质怒组中,男性TPH基因A218C位点各基因型组控制发怒（AC-O）得分差异有统计学意义（F=3.551,P=0.034）,其余各基因多态性位点不同基因型受试者怒的控制（AC）、控制发怒、控制郁怒（AC-I）的得分差异无统计学意义（P>0.05）。低特质怒组中,对于TPH基因A218C位点各基因型组,怒的控制得分差异有统计学意义（F=5.227,P=0.006）,控制发怒的得分差异有统计学意义（F=5.943,P=0.003）,控制郁怒的得分差异有统计学意义（F=4.104,P=0.018）,女性控制发怒的得分差异有统计学意义（F=3.527,P=0.032）；对于MAOA基因rs2235186位点,女性各基因型组控制发怒的得分差异有统计学意义（F=3.383,P=0.037）；其余各基因多态性位点不同基因型受试者怒的控制、控制发怒、控制郁怒的得分差异无统计学意义（P>0.05）。4.高、低特质怒组特质怒、怒的表达、怒的控制间的相关性：两组无论是否按男女分层,特质怒与发怒均正相关（r=0.493,P<0.01。r=0.377,P<0.01）,怒的表达与发怒及郁怒均正相关（r=0.521,P<0.01；r=0.751,P<0.01。r=0.393,P<0.01：r=0.885,P<0.01）,怒的控制与控制发怒、控制郁怒均正相关（r=0.940,P<0.01：r=0.952,P<0.01。r=0.952,P<0.01；r=0.954,P<0.01）,控制发怒与控制郁怒均正相关（r=0.791,P<0.0l。r=0.816,P<0.01）；而发怒与怒的控制、控制发怒、控制郁怒均负相关（r=-0.336,P<0.01；r=-0.391,P<0.01；r=-0.252,P<0.01。r=-0.305,P<0.01；r=-0.351,P<0.01；r=-0.231,P<0.01）。结论：1.TPH基因A218C多态性与我国正常大学生中高特质怒者下列愤怒情志特质有关：发怒特质,女性怒的表达特质,男性的郁怒特质及控制发怒特质；该位点多态性还与我国正常大学生中低特质怒者下列愤怒情志特质有关：郁怒特质,怒的控制特质,控制发怒特质,控制郁怒特质及女性的控制发怒特质。2. MAOA基因tag SNP rs2235186多态性与我国正常大学生中低特质怒女性的控制发怒特质有关。3. COMT基因的V158M位点及MAOA基因的30bp-uVNTR、rs1181275、rs5906957.rs5905613和rs58524323多态性与我国正常大学生的愤怒情志特质无关。4.无论是否按男女进行分层,高、低特质怒组愤怒情志特质各维度间均存在如下相关关系：特质怒与发怒特质正相关,怒的表达特质与发怒特质及郁怒特质正相关,怒的控制特质与控制发怒特质、控制郁怒特质正相关,控制发怒特质与控制郁怒特质正相关；而发怒特质与怒的控制特质、控制发怒特质、控制郁怒特质负相关。
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