家蚕核型多角体病毒遍在蛋白及家蚕遍在蛋白的分离纯化

论文题目: 家蚕核型多角体病毒遍在蛋白及家蚕遍在蛋白的分离纯化

论文类型: 博士论文

论文专业: 特种经济动物饲养

作者: 张文波

导师: 张耀洲

关键词: 家蚕核型多角体病毒,抗体,噬菌体肽库,结合肽,非放射性,质谱

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 遍在蛋白（ubiquitin）是一种由76个氨基酸组成的、高度保守的小分子可溶性蛋白质,存在于各种真核生物的胞质和胞核中。目前所知,遍在蛋白主要通过依赖ATP的遍在蛋白-蛋白酶体途径（Ubiquitin-proteasome pathway,UPP）高效并特异选择性地对胞质和胞核内蛋白进行部分或完全降解。此外,遍在蛋白还参与核糖体的生物发生、细胞内吞及其他多种生理功能,并在多种疾病中发挥作用。除了真核生物以外,昆虫病毒是迄今发现唯一编码遍在蛋白的病毒。 本研究从家蚕核型多角体病毒镇江株（BmNPV-ZJ）基因组中克隆了遍在蛋白-39K基因片段。测序和生物信息学分析表明,遍在蛋白-39K基因片段包括两个完整的开放阅读框（ORF）:遍在蛋白（BmVUB）和39K（BmV39K）;遍在蛋白的序列与BmNPV-T3株的序列一致,而与其它昆虫病毒的遍在蛋白序列相差较大;39K序列与BmNPV-T3相比较有3个核苷酸发生同义突变,与昆虫痘病毒的39K序列的同源性很低。绘制的分子进化树结果显示,与以昆虫杆状病毒的其它基因为基础绘制的分子进化树基本一致。BmVUB和BmV39K蛋白质的二级结构主要由a-螺旋和Random coil构成。BmVUB和BmV39K蛋白均可被小遍在蛋白相关蛋白（SUMO）修饰,且BmV39K蛋白被SUMO修饰的概率更高,说明SUMO修饰在BmVUB和BmV39K蛋白功能的发挥过程中起着一定的作用。 构建了pETBmVUB和pGEXBmVUB两种原核表达载体。原核表达结果表明,两种融合蛋白的表达量分别占总菌蛋白的50%和35%左右,且均为可溶性表达。用亲和层析法纯化了两种融合蛋白,并以纯化的（His）6-BmVUB融合蛋白为抗原制备了抗体,并用硫酸铵沉淀和凝胶柱层析法纯化抗体,EIASA测得抗体的效价达到3x10-5。Western Blotting检测抗体的特异性较好。 以（His）6-BmVUB融合蛋白为靶标,对噬菌体12肽库进行亲和筛选。利用ELISA鉴定噬菌体阳性克隆并对其进行DNA序列测定和同源性比较分析、并利用MTT法测定含结合肽的噬菌体对家蚕BmN细胞生长增殖的作用。结果表明,3轮筛选后随机挑取20个噬菌体克隆,ELISA 鉴定表明20个克隆均可与BmVUB结合。随机挑选10个克隆进行DNA测序并推导其氨基酸序列,10克隆可分为5种氨基酸序列类型,每一类氨基酸至少含有3个疏水氨基酸。对这10个阳性噬菌体克隆进一步鉴定,游离BmVUB可阻断10个阳性噬菌体克隆与固相化BmVUB结合。5种结合肽对BmN细胞生长增殖的影响有很大差异,其中VAPHHAYAPMRT肽段

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一部分 文献综述

第一章 遍在蛋白研究进展

1 遍在蛋白-蛋白酶体系统

1.1 遍在蛋白

1.2 与遍在蛋白作用相关的酶

1.3 蛋白酶体

1.3.1 20S蛋白酶体

1.3.2 19S复合体

1.3.3 11S复合体

1.3.4 蛋白酶体的活性

2 遍在蛋白的底物识别信号

3 遍在蛋白化的形式

4 遍在蛋白的作用机制

5 UPP的生物学功能

6 遍在蛋白的应用

7 UPP与临床

第二章 病毒编码的遍在蛋白及相关蛋白

1 病毒编码的UB

2 病毒编码的遍在蛋白相关酶类

第二部分 研究报告

第一章 实验设计

1 研究目的

2 研究意义

3 实验内容

4 实验流程图

第二章 家蚕核型多角体病毒遍在蛋白基因的克隆

1 材料

2 方法

3 结果

4 小结

第三章 家蚕核型多角体病毒遍在蛋白的生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第四章 家蚕核型多角体病毒遍在蛋白的表达、纯化及抗体制备

1 材料与试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第五章 遍在蛋白结合肽的筛选及活性测定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第六章 遍在蛋白序列特异性DNA结合蛋白的初步鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第七章 原核表达BmVUB蛋白的质谱鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第八章 蚕蛹中遍在蛋白的纯化与鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第九章 BmVUB的同源模建

1 方法

2 结果

3 讨论

参考文献

附录

致谢

发布时间: 2005-10-10

参考文献

• [1].巴西橡胶树43KD橡胶粒子膜蛋白cDNA的克隆及表达[D]. 彭世清.华南热带农业大学2001

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