论文摘要
苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是研究应用最为广泛的生物杀虫剂,实际使用中存在作用速度慢、防效低等弱点。美洲粘虫颗粒体病毒（Pseudaletia unipuncta granulosis virus , PuGV ）是含有增效蛋白（ enhancin）的杆状病毒（Baciluvirus）,能提高核型多角体病毒（nuclear polyhedrosis virus,NPV）的侵染能力及Bt的毒力。本文以Bt和东方粘虫P. separata转主增殖的美洲粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）为材料,明确了PuGV-Ps对Bt的增效作用和增效特性;并从PuGV-Ps对杀虫晶体蛋白的酶解活化、昆虫中肠酶活性的变化、昆虫中肠围食膜（peritrophic membrane,PM）结构的破坏等方面探索了增效机理;克隆和测序了PuGV-Ps增效蛋白基因并原核表达了增效蛋白;研制了PuGV-Ps对Bt的增效制剂,并明确了其应用效果。主要结果如下:1明确了PuGV-Ps对Bt的增效作用以小菜蛾Plutella xylostella、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、棉铃虫Helicoverpa armigera为试虫,采用生物测定方法测定了PuGV-Ps对Bt制剂的增效作用。结果表明Bt中加入PuGV-Ps对3种鳞翅目害虫都具有增效作用,共毒系数达127-146。高温灭活的PuGV-Ps对Bt同样具有增效作用,对小菜蛾的共毒系数达135.8,说明PuGV-Ps中含有对Bt毒力增强作用的增效因子。PuGV-Ps可以提高Bt对小菜蛾的杀虫速度,250μg/mL浓度的Bt中加入PuGV-Ps较单用Bt致死中时间LT50缩短了37.8%。转Bt基因的抗虫棉叶经PuGV-Ps处理后饲喂棉铃虫死亡率也得到相应提高。PuGV-Ps还能增强Bt对甜菜夜蛾生长发育的抑制作用,表现为幼虫生长量相对减少、蛹重下降、化蛹率降低和化蛹历期延长。2分离纯化了PuGV-Ps增效蛋白并测定其对Bt的增效活性用PuGV感染东方粘虫获得的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps的包涵体中含有分子量为108 kD的增效蛋白。PuGV-Ps经碱溶、Sephadex G-200凝胶过滤层析分离获得部分纯化的增效蛋白。以小菜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫等3种鳞翅目昆虫为试虫测定部分纯化的增效蛋白对Bt的增效作用,联合作用的共毒系数在116-155之间,表明PuGV-Ps增效蛋白是一种增效因子,可以增强Bt鳞翅目昆虫的毒力。3探明了PuGV-Ps对Bt增效作用的影响因子PuGV-Ps对Bt的增效程度随PuGV-Ps量的变化而不同,试验范围内不同配伍的PuGV-Ps和Bt间的共毒系数在105.3至195.0之间,其中以Bt∶PuGV-Ps为4∶1增效作用最明显,72 h LC50为0.039 mg/mL。不同温度和pH都影响PuGV-Ps对Bt的增效作用,16℃20℃增效程度明显高于24℃32℃,而碱性条件下（pH 8-9）增效作用更显著。PuGV-Ps对Bt的增效作用因小菜蛾龄期不同而变化,2、3龄幼虫试验,小菜蛾死亡率较Bt分别提高了50%和30.31%,而对低龄（1龄）和高龄（4龄）幼虫增效不显著。PuGV-Ps饲喂2 h后接毒Bt,小菜蛾死亡率明显提高,48 h死亡率达66.67%,较Bt+PuGV-Ps处理死亡率提高了53.87%,差异显著。4分析了PuGV-Ps对苏云金杆菌δ-内毒素的酶解活化作用用氨苯磺胺偶氮酪蛋白为底物测定PuGV-Ps中总蛋白酶活力表明,PuGV-Ps在pH 7.38-10.38的碱性条件下均具有一定的蛋白酶活性,且蛋白酶活力随pH的升高而显著提高。4种蛋白酶抑制剂都能抑制PuGV-Ps的蛋白酶活力,以大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）的抑制作用最强,表明PuGV-Ps的蛋白酶活性是以胰蛋白酶为主要活力的多种蛋白酶的活性特征。通过SDS-PAGE研究了PuGV-Ps对苏云金杆菌δ-内毒素的降解活化作用,结果表明,碱性条件下Bt晶体蛋白和PuGV-Ps共同孵育,130 kD的δ-内毒素被进一步酶解成分子量为110 kD、87 kD、61 kD、47 kD等多种不同分子量的肽链,其酶解活化程度随缓冲液pH的升高而加深,在pH 10.7的0.1 mol Na2CO3缓冲液中,δ-内毒素被完全酶解,产生具有一定抗蛋白酶继续降解能力的分子量为47 kD、60 kD和61 kD的活性片段。同时PuGV-Ps量的多少和碱解时间都影响δ-内毒素的酶解活化程度,STI能一定程度抑制PuGV-Ps对δ-内毒素的酶解活化。5明确了PuGV-Ps抑制甜菜夜蛾中肠液对δ-内毒素的过度降解PuGV-Ps具有蛋白酶活性,对甜菜夜蛾中肠酶液离体蛋白酶活力及取食PuGV-Ps后总蛋白酶活力影响测定表明,在中肠酶液适宜pH范围（pH 9.38-10.38）内,PuGV-Ps都一定程度抑制了中肠酶液的总蛋白酶活力。SDS-PAGE试验显示,PuGV-Ps影响了甜菜夜蛾中肠酶液对苏云金杆菌δ-内毒素的降解活化作用,表现在对中肠酶液酶解130 kD的δ-内毒素成60 kD-87 kD的较大分子量的活性多肽无明显影响,但对活性多肽的进一步降解具有抑制作用,这种过度降解的抑制作用在25℃-30℃的温度和随酶解时间的延长更为显著。不同缓冲液同样影响甜菜夜蛾中肠酶液对δ-内毒素的降解,Na2CO3盐的存在是影响降解程度的重要因子。6证实了PuGV-Ps并发现Bt对甜菜夜蛾中肠PM结构的破坏作用利用环境扫描电镜和SDS-PAGE电泳技术研究了Bt、PuGV-Ps及其增效蛋白对甜菜夜蛾中肠PM的影响。电镜观察结果表明,正常的甜菜夜蛾PM外壁有韧性,表面较平滑,少皱褶,内壁表面较粗糙,有较厚质感,无孔洞和缝隙;取食PuGV-Ps或增效蛋白后的PM外壁皱缩,内壁平滑、质薄;Bt单独作用于PM同样改变了围食膜结构,但影响程度较小;但不同处理未发现对甜菜夜蛾PM造成穿孔或裂缝。中肠PM蛋白的SDS-PAGE试验表明,取食PuGV-Ps和增效蛋白后,PM上200 kD、150 kD、80 kD的大分子量的蛋白一定程度被降解成78 kD以下的小分子量蛋白带,小分子量27 kD的蛋白也被部分降解,而分子量为28 kD的小分子蛋白同时被完全降解;Bt也影响了PM蛋白的构成,取食Bt的PM蛋白电泳减少了28 kD的小分子蛋白,说明甜菜夜蛾PM上28 kD的蛋白是PuGV-Ps增效蛋白和Bt的共同靶蛋白。离体降解试验进一步证明Bt及增效蛋白对甜菜夜蛾PM上28 kD蛋白具有降解作用。7克隆和测序了PuGV-Ps增效蛋白的全长基因以PuGV-Ps的DNA为模板,参考粉纹夜蛾颗粒体病毒（TnGV）和棉铃虫颗粒体病毒（HaGV）的增效蛋白基因序列设计引物,通过PCR反应扩增出一条2.7 kb的特异性基因片段。纯化的PCR产物克隆到载体质粒pEASY-E2中,构建了重组质粒pEASY-En;用DNA双链测序法测定重组质粒pEASY-En中的外源基因序列,证明PCR扩增的产物是PuGV转宿主病毒PuGV-Ps增效蛋白的全长基因。与原始PuGV基因组增效蛋白的序列比较,两者同源性达99.59%,其中5’端500 nt相似性为98.60%,而3’端500 nt仅1个碱基发生突变。说明PuGV-Ps增效蛋白基因的3’端是基因的保守区域。8原核表达了PuGV-Ps增效蛋白并测定了表达蛋白的增效活性以大肠杆菌BL21（DE3）为感受态细胞,将插入PuGV-Ps增效蛋白基因的重组质粒pEASY-En转化到大肠杆菌中,构建了重组菌,于37℃下通过IPTG诱导表达了108 kD的表达产物。表达的目的蛋白带有6×His标签,能特异性吸附在Ni2+上并得到纯化,证明表达产物是目标增效蛋白。LB培养液中加入0.2%的葡萄糖后有利于增效蛋白基因的表达。生物测定结果表明,粗提的表达产物具有增效活性,可以提高Bt对棉铃虫、甜菜夜蛾的敏感性,600μg/g Bt浓度中加入300μg/g增效蛋白表达产物后甜菜夜蛾死亡率提高了10%,400μg/g Bt浓度中加入400μg/g增效蛋白表达产物后,棉铃虫死亡率由23.67%提高至38.67%,差异显著。随表达产物量的增加,增效作用更为显著。9研制了PuGV-Ps增强Bt制剂,并明确了其应用效果依据PuGV-Ps对Bt的增效作用,采用人工增PuGV-Ps、液体发酵Bt和喷雾干燥加工技术,研制了一种病毒增强Bt可湿性粉剂。该制剂主要成份为PuGV-Ps和Bt,含量为3.0×109OB/g PuGV-Ps·1.0×1010活芽孢/g Bt,共毒系数达162.57。该制剂毒性微毒,大白鼠经口LD50大于5000 mg/kg,无致敏和刺激性,无致病性,对鱼、鸟和蜜蜂均为低毒。田间应用结果表明,对小菜蛾、甜菜夜蛾、水稻纵卷叶螟Canphalocrocis medinalis等多种害虫都有较好防效。2000μg/mL浓度对小菜蛾2 d、7 d的防效达86.74%和79%,较Bt单剂的防效分别提高了23.5%和29.7%,差异显著;对甜菜夜蛾10 d防效达61.22%,与阿维菌素（Abamectin）1000μg/mL防效相当;水稻田使用病毒增强Bt 1500 g/ha对稻纵卷叶螟7 d防效达80.77%,高于Bt单剂71.15%的防效;使用病毒增强Bt对稻田蜘蛛无影响,药后7 d田间蜘蛛减少率为3.92%,而阿维菌素等对蜘蛛杀伤率达34.39%。