中国传统发酵食品中乳酸菌的耐药性评估及功能性菌株筛选

论文摘要

我国传统发酵食品种类繁多,蕴含的微生物种类丰富,其中乳酸菌在改善食品风味,增进食品营养等方面发挥了巨大的作用,但乳酸菌的耐药性近年来成为国内外食品安全领域关注的一个焦点。本文以中国传统发酵食品中的乳酸菌为研究对象,对其耐药性进行了系统分析,同时还筛选得到能生产胞外多糖或γ-氨基丁酸的优良菌株。主要研究工作如下:1.对11种中国传统发酵食品中所含乳酸菌的耐药性进行了较为全面的分析。首先,以7种常用的抗生素为筛子,对这些发酵食品中的耐药乳酸菌进行了统计,发现各种食品中存在不同程度的耐药乳酸菌,且耐药菌的比例与食品原料来源、种类、加工环境及加工方法密切相关。其次,选取从各种发酵食品中分离得到的14株耐药菌进一步深入研究,发现多数存在多重耐药能力,且个别菌株对某些抗生素的抗性极强。通过PCR扩增已知的耐药基因,发现有的菌在质粒和/或染色体上存在耐药基因,而有的菌中不存在这些已知的耐药基因。最后,我们还证实了一些耐药质粒可在多个种属的乳酸菌中水平转移。2.从22种中国传统发酵食品中分离到257株乳酸菌,并用纸层析法筛选到能高产γ-氨基丁酸的优良菌株。通过筛选获得5株能高产γ-氨基丁酸的乳酸菌,经DNA鉴定其中2株为Lactobacillus plantarum、1株为Lactobacillus brevis,1株为Enterococcus faecium、1株为Lactobacillus fermentium。γ-氨基丁酸生产能力最强的是L. fermentium MT133,发酵84 hγ-氨基丁酸产量达到20.57 g/L。进一步对γ-氨基丁酸生产途径中的关键基因gadB进行了序列分析和克隆研究。3.通过菌落观察及菌落拉丝法从257株乳酸菌中筛选得到能高产胞外多糖的乳酸菌。筛选获得4株能高产胞外多糖的乳酸菌,经DNA鉴定其中1株为Leuconostoc mesenteroides、1株为Lactobacillus plantarum SHC096、2株为Streptococcus thermophilus。Ln. mesenteroides MT257的菌落表面产粘液,而L. plantarum和S. thermophilus能在菌落拉丝时形成5-160 mm的粘丝。进一步考察了温度和碳源对这些乳酸菌生产胞外多糖的影响,发现最适生长温度有利于胞外多糖的生产,而低温条件（25℃）有利于粘性胞外多糖的形成;乳糖有利于S. thermophilus和Ln. mesenteroides产胞外多糖,而蔗糖有利于L. plantarum产胞外多糖。乳酸菌Ln. mesenteroides MT257胞外多糖的产量可达350 mg/L。本论文初步对中国传统发酵食品中乳酸菌的种属和功能的多样性进行了分析,实验证明了发酵食品中的乳酸菌有的对健康有益,也有的存在食品安全隐患。研究结论为中国发酵食品安全评价和发酵食品中微生物体系的改良优化提供了理论依据,有一定的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章引言
• 1.1 乳酸菌与发酵食品
• 1.2 乳酸菌与耐药性
• 1.2.1 抗生素与微生物的耐药机制
• 1.2.2 乳酸菌耐药性的研究进展
• 1.3 乳酸菌与γ-氨基丁酸
• 1.4 乳酸菌胞外多糖
• 1.5 课题研究内容
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 培养基
• 2.1.2 菌株、载体、引物
• 2.1.3 工具酶、试剂及试剂盒
• 2.1.4 发酵食品及来源
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 分子生物学及微生物学的基本操作
• 2.2.1 质粒及基因组DNA 的提取
• 2.2.2 PCR 反应及反应产物的检测与纯化
• 2.2.3 质粒和PCR 产物的酶切连接
• 2.2.4 乳酸菌的微生物学鉴定及保藏
• 2.2.5 细菌的分子生物学鉴定
• 2.2.6 革兰氏阳性细菌的电转化
• 2.3 传统发酵食品中乳酸菌耐药性的初步研究
• 2.3.1 传统发酵食品中耐药乳酸菌比例的统计
• 2.3.2 最小抑制浓度（MIC）的测定
• 2.3.3 耐药基因的PCR 检测
• 2.3.4 耐药质粒的水平转移试验
• 2.3.5 PCR-DGGE 分析泡菜样品中的微生物群落
• 2.4 传统发酵食品中产GABA 乳酸菌的筛选与鉴定
• 2.4.1 传统发酵食品中乳酸菌的分离与初步鉴定
• 2.4.2 产GABA 乳酸菌的筛选与鉴定
• 2.4.3 考察发酵时间、底物及添加剂浓度对乳酸菌产GABA 的影响
• 2.4.4 产GABA 乳酸菌中的gadB 基因的克隆
• 2.5 传统发酵食品中产EPS 乳酸菌的筛选与初步研究
• 2.5.1 乳酸菌EPS 的提取与分析方法的建立
• 2.5.2 产EPS 乳酸菌的初筛、复筛与菌株鉴定
• 2.5.3 培养温度及碳源对乳酸菌EPS 形成的影响
• 2.5.4 碳源对乳酸菌EPS 形成的影响
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 传统发酵食品中乳酸菌耐药性的初步研究
• 3.1.1 中国传统发酵食品中耐药乳酸菌的比例统计
• 3.1.2 耐药乳酸菌呈现多重耐药性
• 3.1.3 耐药乳酸菌的耐药机制存在复杂多样化
• 3.1.4 耐药乳酸菌中耐药质粒的跨种属转移研究
• 3.1.5 发酵食品中的耐药乳酸菌是否其优势菌群？
• 3.1.6 阶段小结
• 3.2 传统发酵食品中产GABA 乳酸菌的筛选与初步研究
• 3.2.1 产GABA 乳酸菌的筛选与鉴定
• 3.2.2 乳酸菌产GABA 的影响因素初探
• 3.2.3 L. fermentium MT133 中gadB 基因的克隆
• 3.2.4 阶段小结
• 3.3 传统发酵食品中产EPS 乳酸菌的筛选及初步研究
• 3.3.1 蒽酮比色法测定的葡萄糖标准曲线
• 3.3.2 高产EPS 乳酸菌的筛选与鉴定
• 3.3.3 培养温度对乳酸菌产EPS 的影响
• 3.3.4 碳源对乳酸菌产EPS 的影响
• 3.3.5 阶段小结
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.1.1 对11 种中国传统发酵食品中所含乳酸菌的耐药性进行了较为全面的分析
• 4.1.2 中国传统发酵食品中高产GABA 乳酸菌的筛选、发酵优化及关键基因克隆
• 4.1.3 中国传统发酵食品中高产EPS 乳酸菌的筛选及初步研究
• 4.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文