微流控芯片检测单个细胞内O2-.的研究

论文摘要

细胞是生物体结构和生命活动的基本单位。探索生物体生命活动的规律与本质,必须以研究细胞为基础。群体细胞分析容易忽略细胞之间的差异,而单细胞分析则是分析化学、生物学和医学之间渗透发展形成的跨学科领域,能够很好的解决这一问题。特别是单个细胞内化学组分定量检测,对于了解基本的细胞功能、细胞内外联系以及检测和鉴别大量细胞群体中少量不正常的细胞都大有裨益。超氧是其他活性氧的先导,一旦过量产生,不仅对大量的生物分子有毒害作用,而且还会转化成更毒的自由基如羟基自由基、过氧化氢等。因此,超氧的检测对于研究细胞代谢和细胞毒素发病机理方面具有重要意义。微流控芯片,又称微全分析系统或者芯片实验室,1990年由Manz与Widmer提出。近年来,微流控芯片进行单细胞研究备受关注,由于它具有其通道尺寸与细胞直径相当、试剂消耗少、分析速度快等优点。微流控芯片发展的目标是微型化、集成化、自动化、简单化。目前,集成微泵和微阀的微流控系统虽已应用于单细胞组分分析,不过,由于微米级的芯片通道,它的建立还是相当困难。在简单芯片上进行单细胞组分分析通常是由不同液面差产生的静压力与电场力的结合或者电场力来实现,而伴随的进样方式通常是简单进样、夹流进样和门式进样。这三种进样方法均使细胞进样、细胞装载、细胞捕获由两步操作完成,另外,由于微米级通道尺寸,细胞恰好被控制在芯片通道的交叉位置具有一定的难度。总之,上述方法用于单细胞分析,步骤繁琐、耗时。目前,微芯片检测超氧仅有一篇报道,其操纵手段为静压力与电场力的结合,进样模式为夹流进样,探针是选择性差的二氢乙锭（DHE）。本文建立了基于微流控芯片门式进样与夹流进样相结合的方法进行单细胞内超氧的检测,高选择性的2-氯-1,3-二苯并噻唑啉环己烷（DBZTC）作为探针,解决了以上操作方法的不足,主要开展了以下两部分的研究工作:（一）基于微流控芯片电动门式进样（装载阶段）与夹流进样（分离阶段）结合的方法检测单个肝癌细胞内的超氧阴离子。本室合成探针2-氯-1,3-二苯并噻唑啉环己烷（DBZTC）能与超氧特异性反应。超氧氧化产物（DBO）的流形图证明进样阶段为门式进样模式（装载阶段）。细胞进样、细胞装载、细胞捕获一步自动化完成。细胞在15s内被快速捕获。细胞活性实验证明进样电场强是否适当。DBO线性范围为2.1-102.8 amol,检测限（S/N = 3）为0.82 amol （8 nM）。平均单个细胞内超氧的含量与分离效率分别为6.22±3.49 amol和4.73×104理论塔板数。此方法加快了单细胞分析的进度。（二）基于微流控芯片静压力门式进样（装载阶段）结合电动夹流进样（分离阶段）的方法用于单个肝癌细胞内的超氧阴离子的检测。本室合成的2-氯-1,3-二苯并噻唑啉环己烷（DBZTC）作为荧光探针。荧光染料罗丹明6G的流形证明进样阶段为门式进样模式（装载阶段）。细胞密度范围宽（1×105–1.0×106 cells?mL）,进样时间短（4s）。细胞进样、细胞装载、细胞捕获一步完成。DBO的线性范围与检测限（S/N = 3）分别为2.1- 103 amol和1.0 amol。平均单个细胞内的超氧含量为7.82±3.87 amol。此方法简单、快速、准确。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1 微流控芯片在单个细胞操作中的应用
• 2 微流控芯片在单细胞组分分析中的应用
• 3 本章小结
• 4 本文的研究内容
• 参考文献
• 第二章 基于微芯片电动门式进样与夹流进样结合的方法检测单个肝癌细胞内的超氧
• 1 引言
• 2 实验部分
• 3 结果与讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第三章 基于微芯片静压力门式进样与电动夹流进样结合的方法检测单个肝癌细胞内的超氧
• 1 引言
• 2 实验部分
• 3 结果与讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 结论与展望
• 作者发表的学术论文及参加的课题
• 致谢