论文摘要
研究背景与目的:肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全世界最常见的恶性肿瘤之一,每年新增病例约50万到100万。HCC患者因出现症状而就医时其预后往往就很差了。早期的侵袭和转移是HCC的重要特征以及不良预后的关键因素,其中E-cadherin介导的细胞间粘附在肝癌转移的过程中扮演了十分重要的角色。E-cadherin作为主要的上皮细胞粘附分子,其表达缺失与许多肿瘤细胞的失分化和转移密切相关。E-cadherin正常粘附功能的维持需要与α-catenin、β-catenin、P120ctn及细胞骨架形成一个完整的复合体。上述连环蛋白α-catenin、β-catenin及P120ctn除了维持该复合体的粘附,还可能与细胞信号转导密切相关。P120ctn最早作为酪氨酸激酶SRC的底物而被发现,晚近才发现其属于连环蛋白家族。和已被研究颇多的经典连环蛋白（α-catenin,β-catenin）相比,其生物学功能了解不多。P120ctn和E-cadherin的胞内近膜端结合,调控着细胞间粘附。目前发现在结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、胰腺癌等十几种肿瘤中,均有不同程度的P120ctn细胞膜表达减少或缺失,并常伴有胞浆的异常分布。这提示着P120ctn可能扮演着促进或抑制肿瘤的角色。多数与连环蛋白家族结合或有功能联系的蛋白都属于肿瘤相关基因,如Src家族激酶、受体酪氨酸激酶、Wnt-1,APC等,但P120ctn与肿瘤的具体关系尚不清楚。近来又发现P120ctn是一种新认识的转录抑制因子Kaiso的结合蛋白。Kaiso属于转录因子BTB/POZ锌指结构超家族成员,广泛表达于几乎所有的脊椎动物细胞。Kaiso通过识别启动子区域的CTGCNA（N可以为任意碱基）的DNA序列及甲基化的GPG岛而调控基因的转录,其中前一种识别机制是主要的。这些发现提示:P120ctn可能通过与Kaiso的结合关系间接参与核内Kaiso靶基因的转录调控。目前已经证实,缔合蛋白基因rapsyn和Wnt通路中的xWntll、Siamos均是Kaiso的靶基因。值得注意的是,我们发现在降解细胞外基质中具有重要作用的基质金属蛋白酶2（MMP-2）启动子DNA上有2个Kaiso可以识别的特异序列,MMP-2很可能是Kaiso的靶基因。MMP-2（72KDaⅣ型胶原酶）主要由肿瘤细胞和某些基底细胞如成纤维细胞表达。已经发现在包括HCC在内的许多恶性肿瘤的侵袭转移中,MMP-2均扮演着十分重要的角色,并常常与肿瘤的恶性程度相关。然而,MMP-2基因表达的调控机制尚不十分明了。本实验主要探讨P120ctn-Kaiso复合体是否参与MMP-2的转录调控。明确这些调控过程将有助于深入理解HCC侵袭转移的分子机制。材料与方法:1、通过免疫组化的方法研究58例HCC、17例肝硬化、8例正常肝组织标本中P120ctn及E-cadherin、β-catenin分布表达情况,明确其与HCC临床病理之间的联系。2、从人基因组DNA中PCR扩增出MMP-2启动子DNA,PCR定点突变技术扩增包含有Kaiso结合位点突变的启动子,通过酶切位点KpnI/XhoI一起克隆到报告质粒PGL3-BASIC上;PCR扩增出全长的Kaiso cDNA,通过酶切位点SalI/XbaI克隆到带增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体PEGFP-C3上;通过萤火虫酶活性分析检测Kaiso是否参与MMP-2的转录调控;以染色质免疫共沉淀技术进一步检测Kaiso与MMP2启动子之间是否存在体内结合关系。3、构建P120ctn的腺病毒载体（携带分子标记HA-tag）,用其转染本身不表达MMP2的肝癌细胞株HepG-2。通过RT-PCR、明胶酶谱的方法检测过度表达的外源性P120ctn是否可以诱导HepG-2细胞分泌MMP-2。利用Transwell小室检测外源性P120ctn的表达是否能增强HepG-2细胞的运动和侵袭能力。结果及结论:1、P120ctn在正常肝组织中只见胞膜染色,而HCC和肝硬化组织中分别有38/58（65.5%）、8/17（47.1%）出现异常表达。P120ctn的异常表达主要表现为胞膜表达减弱或缺失,并伴胞浆分布。P120ctn的异常表达与HCC的包膜形成、淋巴浸润、有无卫星灶、肿瘤分化等均相关,而与性别、年龄、瘤体积大小、分期无关。而E-cadherin与β-catenin的异常表达仅与肿瘤包膜形成和肿瘤分化有关。P120ctn在HCC和肝硬化组织中异常表达的比例显著高于E-cadherin（44.8%）和β-catenin（37.9%）,且P120ctn与E-cadherin或β-catenin的表达无关,提示P120ctn可能是HCC转移的更早期事件。P120ctn可以作为一个新的预测肝癌转移的因子。2、成功构建了多个包含Kaiso结合部位突变的PGL3-MMP-2启动子报告质粒,构建了真核表达载体PEGFP-Kaiso。运用荧虫酶活性分析技术证实Kaiso蛋白可以抑制MMP-2启动子活性,而P120ctn可以减轻这种抑制效应;运用染色质免疫共沉淀技术证实了在HepG-2 cells细胞中,Kaiso蛋白与MMP-2启动子存在结合关系。这些发现首次证实了MMP-2是Kaiso的靶基因。3、把HA-tag和P120ctn基因成功克隆入腺病毒载体中,获得包含P120ctn基因的重组腺病毒。该腺病毒可高效介导P120ctn在HepG-2细胞中表达（感染效率几近100%）。运用RT-PCR、明胶酶谱法等证实了重组腺病毒Ad-P120ctn可以诱导HepG-2细胞株分泌高水平的MMP-2;运动侵袭实验证实了Ad-P120ctn转染可以增强HepG-2细胞的运动和侵袭能力。
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