论文摘要
本论文以钝顶螺旋藻（Spirμlina platensis FACHB314）基因组为模板克隆了藻蓝蛋白α亚基基因cpcA以及催化脱辅基蛋白与色基结合的裂合酶基因cpcE和cpcF,连同铁氧蛋白氧化还原酶基因pcyA和亚铁血红素氧化酶基因hoxl（模板为Synechocystis sp.PCC6803基因组DNA）,在大肠杆菌体内实现了利用螺旋藻自身裂合酶催化合成具有荧光活性的螺旋藻藻蓝蛋白α亚基。在研究过程中同时发现藻蓝蛋白α亚基可以在没有裂合酶的情况下与藻蓝胆素自我催化结合,但是结合效率很低,其荧光强度仅为有裂合酶催化的藻蓝蛋白的34%。克隆了钝顶螺旋藻藻蓝蛋白β亚基基因cpcB,以及聚球藻Synechococcus sp. PCC 7002的裂合酶基因cpcT、cpcU和cpcS（7002）,集胞藻Synechocystis sp. PCC6803的裂合酶基因cpcS（6803）。通过构建不同的表达菌株分别比较了裂合酶CpcT、CpcU、CpcS（7002）、CpcU/CpcS（7002）、CpcS（6803）对螺旋藻藻蓝蛋白p亚基的催化作用效果。实验结果说明CpcU/CpcS（7002）作为异源二聚体能够有效的催化藻蓝蛋白p亚基与藻蓝胆素的结合,其表达菌株上清液的荧光强度为110.1；而CpcT的催化效率最低,其荧光强度仅为52.71; CpcS （6803）的催化效果居于二者之间,荧光强度为81.69。同时发现藻蓝蛋白p亚基可以与藻蓝胆素自主结合,而且自催化效率比较高,荧光强度与表达菌株BUS（7002）的接近,为111.5。通过构建表达菌株AUS（7002）,发现聚球藻裂合酶CpcU/CpcS（7002）也可以催化藻蓝蛋白α亚基与藻蓝胆素PCB的结合,其荧光强度为无裂合酶催化的藻蓝蛋白α亚基的1.8倍。克隆了钝顶螺旋藻藻蓝蛋白基基因cpcBA、ussBcpcBA,通过建立各种表达菌株比较了α和β亚基均存在的情况下以及带有藻蓝蛋白自身启动子的情况下,裂合酶CpcE/CpcF, CpcU/CpcS（7002）对藻蓝蛋白的催化效果。实验结果说明同时表达αβ亚基的表达菌株的蛋白合成效果比仅含有α亚基或β亚基的表达菌株的效果好。其中表达菌株uBA-EF的表达效果最好,其最大发射峰为640nm,最接近天然藻蓝蛋白的最大发射峰（645nm）,而且荧光强度最高（369.2）。因此推测可以参照表达菌株uBA-EF构建水稻中有荧光活性的螺旋藻藻蓝蛋白的表达体系。本文通过研究螺旋藻藻蓝蛋白的自催化作用以及对不同藻蓝蛋白裂合酶功能的比较研究,利用大肠杆菌表达体系探索具有荧光活性的螺旋藻藻蓝蛋白的合成机理,为在水稻中表达具有荧光活性的藻蓝蛋白提供理论和实验基础。