脑肿瘤干细胞及其免疫治疗的前期实验研究

论文摘要

一、目的意义脑肿瘤严重危害人类健康。据统计,恶性脑肿瘤占人类所有癌症患者的2%,占儿童全身肿瘤发病率的20%～25%,综合发病年龄高峰在30～40岁,或10～20岁。其中又以胶质细胞瘤发病率最高,约占恶性脑肿瘤40.49%。胶质母细胞瘤是最常见的成人原发性恶性脑肿瘤,病人从确诊开始的中间生存时间是15个月,由于胶质细胞瘤分化不全、且深入神经细胞深处,常规的抗肿瘤措施,包括手术、放疗和化疗都很难有效根除,导致其复发率较高。最近研究发现,在脑胶质瘤中存在一种数量极少具有干细胞的特性的细胞,正是这类细胞导致胶质瘤产生和复发,这类细胞已经定义为脑肿瘤干细胞（Brain tumor stem cells,BTSCs）。BTSCs存在于恶性脑胶质瘤的事实最早由Ignatova等（2002年）报道,他们将脑胶质瘤细胞在神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）培养条件下进行培养,结果发现有克隆形成,其细胞表达NSCs标记物Nestin,分化细胞则同时或单独表达神经元特异性烯醇化酶（neurone specific enolase,NSE）、神经胶质细胞纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和神经元β-Ⅲ微管蛋白（neuronal beta—Ⅲtubulin）等并有基因转录,提示这类细胞具有NSCs特性,具有为神经元和胶质细胞的能力因而,把这类细胞称为肿瘤干细胞样细胞（tumor stem-like cells）,并认为其与肿瘤起源和生长有关。此后,又有Singh等（2004年）发现,脑肿瘤中几乎所有的细胞增殖均由一小部分表达人类干细胞标志物CD133+的细胞即BTSCs产生。在培养基中,这些细胞可以增殖并分化为神经元和（或）胶质细胞,比例、表型与原肿瘤一致。这些新生的肿瘤细胞又可以在培养基中产生新的肿瘤细胞,证明它们是肿瘤细胞而不是被肿瘤样本污染的正常NSCs。Hemmati等（2003年）对小儿髓母细胞瘤和胶质瘤进行研究,也发现存在与NSCs性质相似的细胞,它们在体外可形成神经球,能够自我更新,且具有多分化潜能,在一定环境中可分化成具有神经元和/或胶质细胞表面标志的细胞,细胞比例与原肿瘤相似,提示其参与了脑肿瘤的形成;与正常NSCs不同的是,这些细胞表现出异常的增殖能力,其共同特征是:（1）表达NSCs特异性标记,如Nestin、CD133等;（2）具有自我更新和增殖能力,可以成为永生细胞;（3）在异体原位移植后,可以分化为与原肿瘤相似表型和核型的肿瘤。树突状细胞（dendritic cells,DCs）是体内的专职抗原呈递细胞,具有活跃地摄取、处理抗原的能力,并表达高水平的主要组织相容性复合体（majorhistocompatibility complex,MHC）-Ⅰ、Ⅱ类抗原和CD80、CD86等共刺激分子,因而能有效地向T细胞呈递抗原、激发初次细胞免疫应答。利用DCs的这一重要功能,基于DCs的肿瘤疫苗是肿瘤免疫治疗的重要途径之一,并结合BTSCs特点,本研究以临床胶质瘤组织为研究对象,在分别分离纯化鉴定BTSCs及DCs的基础上、重点探讨以BTSCs为免疫原性的DCs融合瘤苗对胶质瘤的免疫杀伤作用,探讨免疫治疗新方法。DCs疫苗的构建方法很多,如肿瘤细胞mRNA冲击DCs法、肿瘤细胞抗原多肽冲击DCs法、肿瘤细胞裂解物冲击DCs法、抗原基因修饰DCs法等。随着对肿瘤细胞融合特性研究的深入以及树突状细胞的发现,利用抗原呈递细胞（尤其是DCs）和肿瘤细胞的融合细胞疫苗来诱导抗肿瘤免疫已经成为学术界的关注领域。而BTSCs的发现,又进一步为脑胶质瘤的免疫治疗提供了新的思路。相对于肿瘤细胞与DCs融合的肿瘤免疫治疗能有效抑制肿瘤生长的前期工作,BTSCs与DCs融合的胶质瘤免疫治疗将更具优势,更为理想。本研究将从手术中获取的不同级别脑胶质瘤标本进行免疫磁珠分选,得到CD133+和CD133-的胶质瘤细胞,并抽取同一个病人的外周血,分离得到树突状细胞,用电融合的方法,分别把CD133+和CD133-胶质瘤细胞与同源的树突状细胞融合,融合后的两种细胞分别用于刺激同源的T淋巴细胞,再用这些致敏的T淋巴细胞,杀伤同源的原代胶质瘤细胞,观察该方法是否能更有效的杀伤胶质瘤细胞。二、方法本实验分为三部分:第一部分:原代CD133+和CD133-的胶质瘤细胞获得和分选。收集手术中取得的胶质瘤标本,经过剪切、消化等措施,用DMEM/F12培养基加胎牛血清原代培养,培养至第3～5天取部分原代细胞、用流式细胞仪检测其中CD133阳性细胞的表达率,再取部分细胞用免疫磁珠分选法分选其中的CD133+胶质瘤细胞。分选后的CD133+胶质瘤细胞在DMEM/F12培养基加B27、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和白血病细胞抑制因子（Leukemiainhibitory factor,LIF）等细胞因子,原代无血清培养成悬浮肿瘤球后用带有红色荧光标记物（藻红蛋白标记,Phycoerythrin,PE）的羊抗人CD133抗体标记,荧光显微镜下观察。主要观察和比较CD133+细胞和CD133细胞在第7天、第14天光镜下20个随机视野胶质瘤细胞肿瘤球的数目;形成的肿瘤球再放入含有胎牛血清的DMEM/F12培养基,并于第8天用免疫细胞化学法检测贴壁的肿瘤球NSE和GFAP表型。第二部分:DCs的诱导培养和鉴定。用淋巴分离液分离胶质瘤患者外周血单个核细胞（Peripheral bloodmononeuclear cells,PBMCs）,培养2小时后的贴壁PBMCs,用含有粒—巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）和白细胞介素（Interleukin—4,IL-4）的培养基,在37℃、5%CO2,的恒温培养箱内培养,第5天开始加肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）,刺激DCs成熟,在倒置显微镜下观察细胞形态。在第8～10天收获成熟的DCs,并用流式细胞仪检测DCs表面的CD14、CD83、CD80、人类白细胞抗原（Human leukocyte antigens D-related,HLA—DR）、CD1a和CD86六种表面标志物。第三部分:融合瘤苗的制备,T淋巴细胞的制备及体外刺激和细胞毒性实验。CD133+和CD133-的胶质瘤细胞的分选同第一部分。DCs的诱导培养同第二部分。利用电融合的方法将DCs与CD133+和CD133-的胶质瘤细胞分别按5:1的比例进行融合。并用DCs与转染有绿色荧光蛋白的胶质瘤细胞融合,通过荧光显微镜下观察及流式细胞仪检测来鉴定融合。用人T细胞富集液（Human T cell enrichment cocktail）（StemCell公司产品）孵育抽取的胶质瘤患者同源外周血,再用淋巴细胞分离液分离这部分外周血,得到T淋巴细胞;用白细胞介素（Interleukin—2,IL-2）加入到含有血清的RPMI1640培养基,培养T淋巴细胞;用流式细胞仪检测淋巴细胞表面CD3分子。把分离好的T淋巴细胞分别与两种融合细胞（DCs-CD133+融合细胞及DCs—CD133-融合细胞）及原代胶质瘤细胞、DCs与胶质瘤细胞的混合细胞、单纯DCs共培养3天。第2天用ELISA法检测各组的干扰素（Interferon—γ,IFN-γ）含量,第3天用前述五组的混合细胞作为效应细胞,分别与同源的原代胶质瘤细胞（靶细胞）在96孔板内共培养,用CytoTox96 Non-Radioactive CytotoxicityAssay（Promega公司产品）检测T淋巴细胞杀伤作用。统计学分析:全部数据采用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析,常规进行方差齐性检验、正态性检验。计量资料实验数据以均数±标准差（（?）±SD）表示。单变量两组资料之间的比较采用t检验,多组资料之间的比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异,有统计学意义。三、结果不同原代胶质瘤细胞中含有约0.8%～12.4%的CD133+胶质瘤细胞,荧光显微镜下示肿瘤球成红色荧光,表明携带有CD133表面分子,CD133+细胞比CD133-细胞具有明显增殖能力,且CD133+细胞能分化成表达NSE和GFAP表面分子的肿瘤细胞。（图1-1,1-2,1-3）。这类细胞在胶质瘤组织中的含量非常稀少,大部分在1%左右,在恶性程度较高的胶质瘤组织（胶质瘤病理分级为Ⅳ级）中含量较高,可达10%以上。（图1-4）培养第8～10天的DCs,在倒置显微镜下表现为大量突起和毛刺,符合成熟DCs的形态;流式细胞仪检测结果显示,PBMCs标志物CD14低表达,DCs表面标志物HLA—DR、CD80、CD86等表面分子高表达（表2-1）。由此提示,从病人外周血中分选并诱导得到了较高纯度的成熟DCs。利用电融法获取了DCs与CD133+细胞,DCs与CD133-细胞的融合细胞。荧光显微镜下结果显示:成功地获得了融合细胞（图3-2）,流式细胞仪检测其融合率平均达12.6±2.084%,与国外学者的结果基本一致（图3-3）,提示本实验操作误差控制到最小范围,技术方法是可靠的。T淋巴细胞的分选,经流式细胞仪鉴定证明纯度可高达90%以上,成功得到了T淋巴细胞。ELISA法检测显示,T淋巴细胞能被融合细胞有效激活致敏,IFN-γ的含量在两种融合细胞组之间未见显著统计学差异,但两种融合细胞组与其他三组相比,前者IFN-γ的含量显著增多。细胞毒性杀伤实验表明,两种融合细胞组致敏的T淋巴细胞与其他三组相比能更有效的杀伤胶质瘤细胞（表3-1,图3—4,3—5）。四、结论原代胶质瘤组织细胞经免疫磁珠分选法分选后,在含有B27、EGF、bFGF和LIF细胞因子的DMEM/F12培养基内,能成功培养出CD133+细胞。这类细胞悬浮生长在上述培养基内,可增殖成有许多细胞组成的细胞球。把这些细胞球转入含有血清的DMEM/F12培养基内后,可贴壁生长、并向表达NSE、GFAP的下级细胞分化。而CD133-细胞则很难在上述无血清培养基内长期分裂增殖。胶质瘤患者外周血单个核细胞经GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子刺激诱导培养,可获取具备典型特征及细胞表型的成熟DCs。胶质瘤干细胞与DCs经电融合,可成功获得融合瘤苗,融合瘤苗体积明显增大,具有活化T淋巴细胞分泌IFN—γ的功效。细胞毒性杀伤实验表明,CD133+细胞与DCs的融合细胞、CD133-细胞与DCs的融合细胞均能明显活化T淋巴细胞杀伤胶质瘤细胞,而单纯DCs、单纯胶质瘤细胞以及DCs与胶质瘤细胞混合培养的细胞则均不能产生显著的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocy,CTL）反应,两种融合细胞分别活化的T淋巴细胞之间差异没有显著统计学意义。通过检测IFN—γ释放量说明,融合细胞能显著刺激T淋巴细胞分泌IFN—γ,而两种融合细胞之间差异没有显著统计学意义。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• +胶质瘤细胞的分选'>第一部分 原代CD133⁺胶质瘤细胞的分选
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 DCs的诱导培养和鉴定
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 融合瘤苗的制备及T淋巴细胞的杀伤实验
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 中英文缩写对照表
• 综述
• 致谢