论文摘要
抗冻蛋白（Antifreeze Protein,AFP）是生物为适应极端寒冷环境而产生的一类特异性多肽或糖肽。到目前为止国内外研究人员已经从海洋鱼类、昆虫、植物、细菌和真菌等各类生物体中分离得到了多种AFP。虽然不同种类的AFP结构各不相同,但它们都具有相似的抗冻活性,即能以非依数形式降低水溶液的冰点,但不影响其熔点,从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值,表现出热滞活性（THA）;AFP结合到冰晶表面,还具有阻止冰晶形成、调控胞外冰晶的增长及抑制冰的重晶化等作用。由于AFP的热滞活性及重结晶抑制效应,其在食品、医学、生物及化工等领域中具有广泛的应用前景。尽管不同种类的AFP已被分离,其基因序列及结构也被测定,但较低的产率及较高的成本限制了其广泛应用。近来有研究发现,畜禽下脚料中富含的胶原蛋白因其独特的分子结构,可能含有强活性的AFP。因而,本研究拟以猪皮中的胶原蛋白为原料,THA及水解度（DH）为指标,采用可控酶解技术对胶原抗冻肽进行制备和筛选,并对其功能特性进行研究,主要研究内容如下:采用差示扫描量热法（DSC）建立了AFP的THA的测定方法,并考察了保留温度（Th）、胶原蛋白浓度及升降温速率等因素对THA的影响。结果表明,当胶原蛋白浓度为20 mg/ml,Th为0.12℃,升降温速率为10℃/min时胶原蛋白THA最高,为0.61℃。测定胶原蛋白THA时Th的选取至关重要,而升降温速率对THA无显著影响。根据以上研究最终确定的DSC法程序如下:将胶原蛋白溶解于蒸馏水中,配制20 mg/mL的胶原蛋白溶液;当仪器充满液氮并稳定后,将10μL样品于铝皿内保持5 min,按照1.0℃/min的速率进行升降温。首先降温至-20℃保持5min,再升温至10℃并保持5 min,获得胶原蛋白溶液的熔融热（△Hm）和熔点（Tm）。接着,将胶原蛋白溶液降温至-20℃保持5 min,然后缓慢升温至胶原蛋白溶液呈部分熔化状态,即到达其Th,保持15 min,再将温度从Th降至-20℃。DSC法测定胶原蛋白THA的SD和RSD较低,为2.65%和3.11%,表明采用DSC法测定AFP的THA具有较高的稳定性、重复性和精密度。采用可控酶解技术确定了胶原抗冻肽的制备工艺。首先以猪皮为原料,采用胃蛋白酶法制备了I型胶原,并对其纯度及氨基酸组成进行鉴定。结果表明,I型胶原蛋白纯度较高,分子量约为330 KD;在氨基酸组成中,Gly、Ala和Pro含量最高,Gly含量几乎占了1/3,为30.6%;Ala和Pro含量分别为9.9%和11.6%;胶原Pro的羟基化程度较高,为52.46%。再以提取的I型胶原为原料,研究了温度、pH、加酶量、胶原蛋白浓度及DH等因素对酶解产物THA的影响。结果表明,确定碱性蛋白酶对胶原蛋白有最大的水解能力,pH值、DH、胶原蛋白浓度有显著影响。在此基础上,以THA为响应值,设计了三因素三水平的响应面实验,确定了可控酶解技术制备胶原酶解产物的最佳酶解条件为:温度55℃、酶添加量5%、pH 7.8、胶原蛋白浓度20.75 mg/mL、DH 9%,当酶解产物浓度为200 mg/mL时,其THA最高,为5.31℃。对高THA活性酶解产物的氨基酸组成及分子量分布进行了研究,发现高THA活性酶解产物的相对分子质量主要分布在1801000 Da之间,约占72.03%。将高THA活性的酶解复合物加入到冰淇淋中,并考察其对冰淇淋浆料黏度、膨胀率、融化率、微观结构、冰晶生长、重结晶及Tg’的影响。结果表明淇淋浆料的黏度及膨胀率都随酶解复合物浓度的增加而呈增大趋势,当酶解复合物浓度为0.5%时,冰淇淋的黏度和膨胀率达到最大,分别为34.5mPa·s和26.87%;相比于对照组,添加有胶原酶解复合物的冰淇淋开始融化的时间大约滞后8 min,其气泡分布及大小也得到显著改善;胶原酶解复合物还可显著抑制冰淇淋的冰晶生长及重结晶,当酶解复合物添加浓度为0.2%时,开始表现出对冰淇淋的重结晶抑制活性,当酶解复合物添加浓度为0.5%时,表现出最大的重结晶抑制活性;胶原酶解复合物在冰淇淋中的添加也显著升高了冰淇淋的玻璃化转变温度（Tg’）,当酶解复合物添加浓度为0.5%时,冰淇淋的Tg’达到最大,为-17.64℃,这对冰淇淋的玻璃化贮存有着重要的意义;此外,本研究还采用模糊数学的h函数法评价了酶解复合物对冰淇淋感官品质的影响,发现酶解复合物可明显改善冰淇淋的品质,当其添加浓度为0.3%时,感官评价得分最高。
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