论文摘要
苯并（a）芘（Benzo（a）pyrene,B（a）P）暴露与癌症的发生密切相关。随着近年来对细胞周期调控机制研究的不断深入,癌症的发生、发展与细胞增殖失控之间的关系也逐渐被人们所认识。尽管大量的研究证实B（a）P可诱导细胞周期发生改变,然而,迄今为止,有关B（a）P致细胞周期改变的分子机制尚未完全阐明。本课题组前期研究发现,磷脂酰肌醇-3-激酶（PI-3K）和丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）通路均参与调控B（a）P诱导的核转录激活蛋白1（AP-1）的活化以及细胞周期改变。转录因子c-Jun作为AP-1家族的主要成员,其活性在受到多条信号通路调节的同时,也可通过介导特定的细胞周期调节因子的表达,参与调控细胞周期进程。但目前对于PI-3K、MAPK和p53通路在B（a）P诱导c-Jun活化中的作用,这些通路之间的相互关系以及c-Jun参与细胞周期调控的具体机制仍不明晰。本研究以人胚肺成纤维细胞（HELF）为实验模型,围绕c-Jun这一中心,研究了PI-3K、MAPK、p53通路与B（a）P诱导c-Jun活化之间的关系,并从影响G1期分布的多个调节因子出发,对c-Jun在B（a）P诱导细胞周期改变中的作用展开深入解析,旨在从信号转导水平系统地探讨B（a）P致细胞周期改变的作用机理,为B（a）P危害的防治及流行病学研究提供科学依据。本研究通过免疫荧光法观察磷酸化c-Jun和c-Jun总蛋白的细胞定位,免疫印迹法检测细胞中MAPK、Akt、p53和c-Jun的蛋白总量及其磷酸化表达水平,利用MAPK、PI-3K通路的显性失活突变体以及p53的化学抑制剂（pifithrin-a）和分子抑制剂（小干扰RNA）证明各通路相关信号分子之间的上下游关系,对B（a）P诱导c-Jun活化的信号转导通路进行研究;进一步将c-Jun的显性失活突变体（TAM67）质粒转染HELF细胞,建立稳定表达TAM67的HELF细胞系,并加以鉴定,运用MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术分析细胞周期分布,免疫荧光法观察cyclin D1的细胞定位,报告基因技术测定cyclin D1的转录活性,免疫印迹法检测细胞中cyclinD1、Rb、E2F1、p53和p21的蛋白表达水平,探讨了c-Jun在B（a）P诱导细胞周期及G1期调节因子改变中的作用。结果显示:1)B（a）P刺激细胞可促进c-Jun活化,并伴随着MAPK、PI-3K、p53和cyclinD1通路各组成成分的活性增强。2)利用MAPK通路的显性失活突变体分别阻断细胞外信号调节激酶（ERK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）活性,均可明显抑制B（a）P诱导的c-Jun活化,但阻断p38活性对B（a）P引起的c-Jun活化无明显影响,提示JNK和ERK通路参与调控B（a）P诱导的c-Jun活化。3)过表达PI-3K和Akt的显性失活突变体也可显著抑制B（a）P诱导的c-Jun活化,并降低磷酸化ERK的表达水平,但对磷酸化JNK的表达水平无明显影响,说明PI-3K/Akt通路通过ERK正性调控了B（a）P诱导的c-Jun活化。4)p53的化学/分子抑制剂能使B（a）P作用的细胞内c-Jun活性明显增加,并同时诱导Akt和ERK的磷酸化水平的升高,表明p53可通过PI-3K/Akt/ERK通路对B（a）P诱导的c-Jun活化进行负性调控。5)随后观察转染细胞的生长情况,发现TAM67对细胞正常生长和形态无明显影响。6)稳定表达TAM67可有效抑制B（a）P诱导的S期细胞数的增加,提示c-Jun在B（a）P致细胞周期改变的过程中发挥了重要作用。7)TAM67过表达能够抑制B（a）P诱导的cyclin D1活化,降低磷酸化Rb以及E2F1蛋白表达水平,表明c-Jun参与调控B（a）P诱导的cyclin D1/Rb/E2F1通路的活化。8)过表达TAM67可使B（a）P刺激的细胞中p53、p21总蛋白以及p53磷酸化的表达水平明显升高,可见c-Jun也参与调控B（a）P诱导的p53/p21通路活化。综上所述,PI-3K/Akt/ERK通路通过p53依赖机制调控B（a）P诱导的c-Jun活化,活化的c-Jun通过cyclin D1/Rb/E2F1以及p53/p21通路参与调控B（a）P诱导的细胞周期改变。本研究以c-Jun为中心,向上追溯到p53、PI-3K和MAPK通路,向下延伸至G1期调节因子,通过c-Jun将多条信号通路连接起来,所得结果加深了对B（a）P致癌分子机制的理解,为深入研究B（a）P的致癌机理提供了线索。